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基因工程的基本技术主要内容基因工程的基本技术之一一、核酸提取技术1、植物组织中基因组DNA的提取(3)、引物延伸温度与时间：2）线状DNA的浓缩与纯化（P31-33）pH值：偏碱性，带负电荷4）、反应缓冲液成分：吸收峰：DNA紫外光260nm体系成分：模板DNA、引物、Taq酶(热稳定性)、dNTP、反应缓冲液（Mg2+、BSA、Tween20、DTT、Tris.基因工程的基本技术之一§、溶液Ⅰ：50mol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl离子浓度：离子浓度高电流大2、幼嫩组织DNA的得率高还是低？对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。4、电泳：接通电源，调好电压荧光域值（threshold）的设定4）、反应缓冲液成分：3、反转电场电泳（FIGE）060-400再思考：1、研磨破碎组织必须在低温下进行。------为什么？ⅱ提取DNA的质量鉴定：DNA的相对完整性：凝胶电泳DNA的纯度：测OD值2、质粒DNA的提取ⅰ质粒DNA提取方法：抽提质粒DNA所需的溶液：实验步骤7、加等量的氯仿/异戊醇（V：V=24：1）抽提，离心；8、移取上清液，加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃静置5min，离心，弃上清；9、用70%乙醇洗DNA沉淀2次，离心，倒掉乙醇，吹干；10、用TE（pH8.0，）溶解质粒DNA，并加入RnaseA达浓度为10μg/ml，37℃放置1小时11、取1μL质粒DNA用于电泳检测。ⅲ抽提出质粒的构型：抽提出的质粒三种构型电泳结果：0），10mmol/LEDTA(pH8.primer1（10M)现配现用；2、把菌液放入Ep管中，离心，弃上清；OD260/280<1.在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。9%0.Endingreaction6%1-20590-500抽提出的质粒三种构型电泳结果：利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。低熔点琼脂糖：用于DNA的回收（65℃）二、凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（一）、影响电泳迁移率的因素操作简单；分辨范围：100bp-60kb；有效范围：200bp-50kb；分辨率：100bp左右常用于微卫星、测序分析；分辨范围：5-500bp；分辨率：1bp♦凝胶分辨DNA的能力：4、电泳缓冲液电泳缓冲液的选择（二）、电泳指示剂和DNA染色剂DNA染色剂（三）凝胶电泳过程1、单向电泳中文名称：聚合酶链式反应PCR操作流程2、PCR反应过程：3、PCR反应体系：1）、引物（寡聚核苷酸）2）、模板DNA：§基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段；§质量要求：不高3）、Taq酶(热稳定性)：§常规酶§高保真酶：ExTaq§LaTaq酶4）、反应缓冲液成分：§BSA、Tween20、DTT、明胶----保护酶作用§Tris.cl提供缓冲作用§(2)、dNTP的浓度：常用100-200µmol/L，不能低于20µmol/L，特异性、保真性；§(3)、模板：主要考虑纯度及使用量对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng.以普通PCR50lreactionsolution为例)§PCRthermalprogram6、PCR的种类F（3）反向PCR：根据已知序列扩增两侧序列的方法。（4）定量PCR实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。原理：通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析。初始模板量X0的对数值与C(T)值之间呈线性关系：logX0=-log(1+Ex)*Ct+logNPCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10´SDcycle6-15研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。荧光信号如何产生？思考题1感谢观看