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基因工程制药技术分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程基因工程最基本的必备的材料：工具酶载体目的基因原核或真核宿主细胞分子克隆的基本过程:分：得到目的基因切：将目的基因和载体用适当的限制性内切酶切割接：将目的基因和载体连接，形成重组子转：将重组子转到适当的宿主细胞中筛：筛选出含正确重组子的宿主细胞，扩增第一节基因工程中常用工具酶工具酶分类使核酸降解的核酸酶类：核酸内切酶、核酸外切酶催化核酸合成的酶类：DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶核酸修饰酶类：甲基化酶，激酶，基团转移酶，磷酸酶等一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease，RE)是由细菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。1．限制性核酸内切酶的分类：Ⅲ型RE；由两种亚基组成。需Mg++，ATP为辅助因子；切割位点靠近识别序列但较难预测。一般在25~27bp范围内切割。现已报道4种。I、Ⅲ型RE酶同时具有限制(剪切)与修饰(甲基化)两种功能并依赖于ATP，切割DNA链的位置远离识别序列，因此I型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中都不常用。Ⅱ型RE实际应用价值最大，这是因为：①Ⅱ型酶只具有限制性活性，无甲基化修饰活性；②对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确；③此类酶作用时只需Mg2+参与，无需ATP。因此Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为“分子生物学家的手术刀”。2．限制性内切酶的命名目前已广泛采用Smith和Nathams于1973年提出的命名系统：限制性内切酶第1个大写字母：来自细菌的属名(genus)，第2、3个小写字母：来自种名(species)，第四个字母代表菌株(strain)3．Ⅱ型限制性内切酶的作用特点：被分子生物学家广泛研究应用，现已发现有200多种识别序列的REMW=60KD的单链多肽最适pH：6~8NaCl有抑制作用，Mg2+激活，巯基有保护作用热不稳定。作用特点：有严格的识别、切割的DNA序列，并以内切的方式水解双链DNA中的磷酸二酯键。识别序列一般为4～6个碱基对。切割靶序列的大小决定了切割DNA链后产生的DNA片段的长短切割后产生平头或粘性末端。只需Mg2+，不需ATP。4.Ⅱ型酶切割dsDNA可产生两种不同的切口1.平头末端(bluntend)即在识别序列的对称轴上进行切割；2.粘性末端(cohesiveend)即在识别序列的两个对称点切开DNA双链，产生末端带有单链尾巴的切口。根据突出端不同分为：5’粘性末端和3’粘性末端。Ⅱ型酶切割dsDNA产生的两种不同的切口5.三类特殊性质的Ⅱ型限制性内切酶：同裂酶(isoschizomer)：又称源同异工酶，即识别位点相同，但切割位点可以相同，也可以不同，例如SamI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓CCGGG)Sau3AIBamHIGATCGGATCCCTAGCCTAGGSauIXhoIGTCGACCTCGAGCAGCTGGAGCTC可变酶：此种酶所识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个碱基对，例如BstpI识别序列为：GGTNACC，其中N为一可变碱基。6.RE识别序列呈反向对称，分为四种类型简并序列（degeneratesequence）又称“松弛”特异识别，即识别位点中某些核苷酸可以被其他核苷酸替换。↓如：ＡｖａⅡ：5’—ＧＧＡ／ＴＣＣ—3’3’—ＣＣＴ／ＡＧＧ—5’↑非回文结构：↓如：ＭｂｏⅡ：5’—ＧＡＡＧＡＮ—3’3’—ＣＴＴＣＴＮ—5’↑7．限制性内切酶的应用8.RE使用时的注意事项二、DNA聚合酶DNApolymerase1．DNA聚合酶I：DNA聚合酶I作用条件：DNA聚合酶I的应用：2．Klenow片段Klenow片段功能：3．T4噬菌体DNA聚合酶应用：5’3’3’5’T4DNApol3’—5’外切活性5’3’3’5’T4DNApol32PdNTP5’3’3’5’ECoRI，BamHIRE消化5’3’5’3’3’5’3’5’凝胶电泳提取纯化特异探针4.TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶的应用TaqDNA聚合酶的应用条件三、DNA连接酶：1．T4噬菌体DNA连接酶主要功能及用途：连接双链DNA中一条链上的切口连接互补粘性末端的DNA片段（连接反应通常在12~15℃下进行）DNA分子间的平头末端（平端的连接通常在室温下进行）四、应用PCR获取目的基因通过基因工程改造，使病毒载体成为只有一次感染能力的重组RV载体。提高真核蛋白表达量的调控措这时可挑选单菌落进行相应的筛选及鉴定分