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基因工程基本操作技术第一节离心技术生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒(细胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离。沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备。离心技术在生物科学，特别是在生物化学和分子生物学研究领域，己得到十分广泛的应用，每个生物化学和分子生物学实验室都要配置各种类型的离心机。一、基本原理∴RCF=1.119×10-5×(rpm)2rrpm---revolutionsperminute为每分钟转数,r/min低速离心时常以转速“rpm”来表示高速离心时则以“g”表示二、离心机的主要构造和类型1、制备性离心机可分为三类离心机一般有离心主机，转头和离心管三部分组成。（1）普通离心机：最大转速6000rpm左右（2）高速冷冻离心机：最大转速为20000～25000rpm（r/min）（3）超速离心机：转速可达50000～80000rpm，装有真空系统，这是它与高速离心机的主要区别。2、转头(2)水平转子(3)区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成。(4)垂直转头：其离心管是垂直放置的。(5)连续流动转头：转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成。DNA中含有蛋白、多糖洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒DNA中残留有金属离子上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致28S和18S条带分不开。③减少物理因素对核酸的降解。液氮长期保存，－70℃短期保存变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀。(3)区带转头：(1)提取物质的结构与性质(与其溶解度有关)如:极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂，碱性物质易溶于酸性溶剂，两性电解质在pI时，溶解度最少。引物和模板的非特异性退火离心操作的注意事项装载溶液时，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管。液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀。若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。根据离心原理,按照实际工作的需要，目前已有可设计出各种离心方法综合起来大致可分为：用差速离心法分离已破碎的细胞各组份常用的梯度材料：1.糖类:蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右旋糖酐、糖原2.无机盐类:CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、NaCl、KBr等3.有机碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等4.硅溶胶:如Percoll。5.蛋白质:如牛血清白蛋白6.重水7.非水溶性有机物:如氟代碳等1.测定生物大分子的相对分子重量沉降速度沉降平衡接近沉降平衡2.生物大分子的纯度估计3.分析生物大分子中的构象变化第二节核酸的提取、纯化与含量测定核酸的分类一、核酸提取的基本原理二、核酸提取的原理1.核酸制备的一般原则(2)核酸纯化应达到的要求：2.核酸制备时应注意的事项:3.核酸制备的一般方法和原理使用扩增级DNaseⅠ处理RNA提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。2、影响提取的主要因素:细胞器DNA，首先纯化细胞器。然后，将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点极为相应的相对离心力数值。降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。沉淀或吸附核酸，并去除杂质用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存①应保证核酸一级结构的完整性合成cDNA第一链合成的引物退火失败(1)提取物质的结构与性质(与其溶解度有关)如:极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂，碱性物质易溶于酸性溶剂，两性电解质在pI时，溶解度最少。01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。③某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。（3）核酸制备中常用的蛋白质变性剂OD260/OD280比值偏低4、核酸提取的一般过程5、核酸样品的保存三、DNA/RNA提取实例细胞破碎2、质粒DNA的提取方法质粒DNA－碱裂解法对数期菌体3、细胞器DNA－差速离心法总结：DNA提取的基本步骤材料准备细胞裂解采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提