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基因工程技术重组DNA技术的发展史细胞的分化潜能DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。DNA克隆目的:①分离获得某一感兴趣的基因或DNA;②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）。基因工程的基本过程和工作原理在这个过程中：1.“基因剪刀”剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀”2.“缝纫针”连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起3.“交通工具”使用载体好比一辆车子4.“乘客”有用基因如IL2好比使乘客，车子把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治疗（IL2/LAK→抗癌）。EcoRI在正常条件下识别并切割5’GAATTC3’序列，但Mendel的豌豆杂交试验polyAtail同一菌株中所含的多个不同的限制性内切酶可用于各种真核生物，并广泛地用于将外源基因导入哺乳动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因，这类载体将来在基因治疗中将具有非常重要的价值。P1人工染色体（P1-derived4限制性内切酶的对DNA的消化作用及其片段化列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等分子克隆（DNA克隆）5、具有粘性末端的DNA片段的两种连接方式。◆载体与目的基因的连接(4)反应的温度：大多数为37℃个体克隆（动物或植物）能像质粒那样在受体细胞中自主复制；碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase）装载量大（45kb），且克隆片段具有一定的大小范围；具有这种潜能的细胞称为全能性细胞。工具酶一、限制性核酸内切酶1.1概念1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶同裂酶（isoschizomer），是来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同。同尾酶（isocaudarner），一类识别不同核苷酸序列但能切割产生相同末端的限制性内切酶，一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。同尾酶产生的相同粘性末端称配伍末端（compatibleend），可用连接酶连接。如SalI与XhoI，BamHI与BglII。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶二、DNA连接酶定义：可以催化具有5’-磷酰基和3’羟基末端形成磷酸二酯酶键的酶。二、DNA连接酶二、DNA连接酶二、DNA连接酶三、聚合酶1.DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)在模板和引物(DNA或RNA)存在的条件下，以dNTP作底物，沿5'→3'方向合成与模板互补的DNA。能够用于M13双脱氧法测序。单链特异性的3'→5'外切核酸酶活性修补经限制性酶消化dsDNA得到的3’隐蔽末端，使其成为平头末端。使用随机引物进行DNA标记在cDNA的克隆中用于cDNA第二链的合成双脱氧法DNA序列测定(Sanger法)。1.来源源于T4噬菌体感染的E.coli。2.酶的活性，相似于Klenow片段，但远远强于Klenow片段（1）5ˊ→3ˊ聚合活性（2）3ˊ→5ˊ外切酶活性（T4pol/Klenow）3.基因工程中用途与Klenow片段一致（参前，标记末端，填平5’末端），不同的是可对3’突出端的DNA分子进行标记。这是用其强劲的3ˊ→5ˊ外切酶活性切除3’突出端，产生3’凹端。T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶3.TaqDNA聚合酶(TaqDNApol，Taqpol）该酶是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有5’－3’聚合活性以及依赖5’－3’聚合酶作用的外切酶活性，聚合酶的最适反应温度是75℃－80℃,37℃活性有10％。该酶的主要用途是进行PCR反应（详参聚合酶链，polymerasechainreaction）一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3’羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。用途：催化DNA的3'末端添加同聚物DNA的3‘末端标记给载体或cDNA加上互补的同聚尾，造成人工粘液末端可以重组。能催化除去DNA的5′磷酸基团，5’-P变为5’-OH；处理后的DNA片段缺少连接酶所要求的5′磷酸末端，因此它们不能进行自连接。可以在克隆时降低载体DNA的背景。小牛肠碱性磷酸酶(CalfIntestinal，CIP)和细菌碱性磷酸酶（bacteriaIntestinalBIP)来源：米曲霉功能：降解ssDNA或RNA，形成5’磷酸末端的单或寡核苷酸。并且对DNA底物的活性比对RNA强。（1