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基因工程基本流程筛选与鉴定1.抗药性筛选法（1）四环素：选择过程（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程2.-半乳糖苷酶显色反应筛选法选择过程3.营养缺陷型筛选法选择过程4.噬菌斑筛选法选择过程基于克隆片段序列的筛选与鉴定缺点：需要电镜A不同克隆的酶切结果基于外源基因表达产物的筛选与鉴定例：小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。3)酶活性检测针对外源基因表达产物是酶。对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。含DHFR的克隆才能生长-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。基于外源基因表达产物的筛选与鉴定载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。载体能够合成某些生长必须营养成分，在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。探针的制备及标记，p60使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。受体菌基因突变不能合成这种生长必须的营养物质。westernblot过程外源基因编码具有特殊功能的酶或活性蛋白，根据抗原抗体反应原理，针对该表达产物设计相应的检测方案针对外源基因表达产物是酶。（2）氨苄青霉素抗性基因：（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程主要检测插入片断是否被转录。基于外源基因表达产物的筛选与鉴定菌落/噬菌斑原位杂交方法：把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。载体能够合成某些生长必须营养成分，Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。PCR鉴定法不适用于大规模转化子的鉴定。抑制细菌生长，但不杀死细菌。载体能够合成某些生长必须营养成分，pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因:酶连（enzyme-linked）二抗：包括：区分重组子与非重组子、期望重组子与非期望重组子、目的片段是否整合在受体基因组上。125I标记的二抗多抗Blotting结果感谢观看