基因工程重组构建与筛选优品文档.ppt

基因工程重组构建与筛选二、平末端DNA片段的连接（二）同聚物加尾法（3）所用动力系统：火药爆炸力双链DNA探针80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限。（3）所用动力系统：火药爆炸力④表达：目的基因随载体同时被复制，转录，翻译涂布（6）活体电穿孔技术放射免疫筛选过程A、制备抗原：培养菌落（噬菌斑）B、制备抗体：免疫动物C、抗原抗体反应D、检测：放射自显影E、选出重组体方法：①插入失活抗生素平板筛选法（pBR322系统）由于外源DNA的插入引起抗药性失活——插入失活（三）电激法(electroperation)三、重组DNA导入动物细胞的方法活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作。活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作。（一）载体介导的转化方法（3）电穿孔转染技术四、斑点杂交（Dotblot）骨骼肌导入促红细胞生成素基因（四）DNA接头连接法接头的一端是齐平的，而另一端是某种内切酶的粘性末端（五）PCR引入酶切位点防止载体自身环化的措施1、碱性磷酸酶脱磷酸基法2、双酶切法3、过量法：基因片段：载体（5:1or10:1)第三节基因转移一、重组DNA导入大肠杆菌1、转化过程E.coli：感受态细胞＋重组DNA分子加入LB扩增涂布选择性平板热激法（HeatShockMethod）（三）电激法(electroperation)1.电转化流程二、重组DNA导入植物细胞的方法（2）叶盘共培养法转化、电激法80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限。为了有效地使细菌吸收外源的DNA分子，我们通常要对它们进行一些物理或化学的处理，处理后的细胞吸收外源DNA的能力大大提高，被称为感受态细胞。电激法是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使基因转移的一种新方法。衔接物是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。骨骼肌导入促红细胞生成素基因三、重组DNA导入动物细胞的方法（一）遗传检测方法原理：根据载体DNA分子上的筛选标记赋予受体细胞在筛选平板上表型的变化。可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。双链DNA探针转化、电激法（1）基因枪法基因枪所用材料：（1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。（2）微注射法（micro-injection）（2）DEAE-葡萄糖转染技术（6）活体电穿孔技术活体电穿孔法在基因治疗方面的应用第四节重组DNA分子的筛选外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况：一、重组体的筛选（一）遗传检测方法原理：根据载体DNA分子上的筛选标记赋予受体细胞在筛选平板上表型的变化。如抗药性引起生长与不长；颜色变化等。方法：①插入失活抗生素平板筛选法（pBR322系统）由于外源DNA的插入引起抗药性失活——插入失活插入失活-环丝氨酸筛选法②放射免疫筛选法1.放射免疫筛选过程A、制备抗原：培养菌落（噬菌斑）B、制备抗体：免疫动物C、抗原抗体反应D、检测：放射自显影E、选出重组体2.放射免疫筛选法优点：①可以选出无表型特征的克隆3.放射免疫筛选法缺点：①必须是表达载体②需要放射性物质——同位素：污染昂贵(三)核酸杂交方法二、核酸探针类型非放射性标记原理三、菌落原位杂交菌落生长转移到NC膜上DNA释放和变性固定杂交洗膜放射自显影查找阳性克隆四、斑点杂交（Dotblot）四、斑点杂交（Dotblot）感谢观看