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基因工程基本流程获取目的基因鸟枪法（shotgun）鸟枪法基本程序第四步，氧化作用(oxidation)。一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。第二步，偶联反应(coupling)。可得到10-30kb的随机片断。第二步，偶联反应(coupling)。（2）构建基因文库的载体选用在基因组文库的构建过程中，严禁外源DNA片段之间的连接。mRNA只占总RNA的1%-2%。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。这也就是为何我们称这种寡核苷酸合成法为磷酸三酯法的原因。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率mRNA只占总RNA的1%-2%。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。化学合成DNA片断的组装第一链合成完毕后，变性去除残留的mRNA，在cDNA的游离3’末端添加OligodC，然后与人工合成的OligodG退火，形成引物结构，聚合第二条链。少数情况下，如为了使目的基因高效表达，也可选用动植物细胞:某一种低丰度mRNA占细胞整个mRNA的比例例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将重组子用SalI切开，凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块，回收DNA片段，根据目的基因内部的特征性酶重复酶切过程直至筛选成功鸟枪法操作的改进-非随机鸟枪法鸟枪法的局限性cDNA法2）cDNA第二链合成-置换合成双链cDNA的克隆cDNA重组克隆的筛选原理：反/逆转录病毒基因复制和表达中间产物多聚U琼脂糖:用于poly(A)较短的mRNA（<20A）酸处理法，脱去与核苷酸1的5’-OH基团偶联的保护基团DMT。mRNA只占总RNA的1%-2%。一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。酸处理法，脱去与核苷酸1的5’-OH基团偶联的保护基团DMT。文库的质量标准（2）构建基因文库的载体选用优点：繁殖迅速，易于保存，克隆操作简便，转化效率高N：所需的重组载体数（克隆数）结果是全保护的DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之间对氯苯。APCR扩增法1.直接从基因组中扩增原核基因组部分（1）提取基因组totalRNA化学合成法固相磷酸三酯合成过程将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。根据构建方法的不同，基因文库分为:基因组DNA文库（genomicDNAlibrary,含有全部基因）cDNA文库（complementaryDNAlibrary,含有全部蛋白质编码的结构基因）基因组文库的大小cDNA文库的大小例如：人的成纤维细胞中，每个细胞内不到14个拷贝的低丰度mRNA约占整个mRNA含量的30%，这种mRNA大约11000种，因此文库的质量标准制备原则：DNA片段之间存在部分重叠、大小均一②常用载体（3）构建基因文库的受体选用基因组文库重组克隆排序感谢观看