用于切除靶核酸的核酸、组合物和方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103228789A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103228789103228789A(43)申请公布日2013.07.31(21)申请号201180051803.4(51)Int.Cl.(22)申请日2011.08.29C12N15/81(2006.01)(30)优先权数据61/378,3502010.08.30US(85)PCT申请进入国家阶段日2013.04.26(86)PCT申请的申请数据PCT/US2011/0496152011.08.29(87)PCT申请的公布数据WO2012/030747EN2012.03.08(71)申请人阿迈瑞斯公司地址美国加利福尼亚州(72)发明人柯尔斯顿·R·本杰明(74)专利代理机构北京万慧达知识产权代理有限公司11111代理人白华胜段晓玲权权利要求书7页利要求书7页说明书48页说明书48页附图2页附图2页(54)发明名称用于切除靶核酸的核酸、组合物和方法(57)摘要本申请提供了一种核酸、组合物、和方法，用于切除宿主细胞基因组的一个或多个基因座。特别地，本申请提供了一种可切除的核酸构建体，从5’至3’方向包括：第一串联重复核酸、第一归巢核酸内切酶识别位点、靶核酸、第二归巢核酸内切酶识别位点、和第二串联重复核酸。在某些实施方式中，可切除的核酸构建体整合至宿主基因组中，通过将归巢核酸内切酶识别位点与一种或多种适宜的归巢核酸内切酶接触，可以将靶核酸从宿主细胞基因组中切除。CN103228789ACN1032879ACN103228789A权利要求书1/7页1.一种可切除的核酸构建体，从5’至3’方向包括：(a)第一串联重复核酸；(b)第一F-CphI核酸内切酶识别位点；(c)靶核酸；(d)第二F-CphI核酸内切酶识别位点；以及(e)第二串联重复核酸。2.根据权利要求1所述的可切除的核酸构建体，其中每个所述第一和第二串联重复核酸独立地由18至200个核苷酸碱基对组成。3.根据权利要求1所述的可切除的核酸构建体，其中每个所述第一和第二串联重复核酸独立地由18至150个核苷酸碱基对组成。4.根据权利要求1所述的可切除的核酸构建体，其中每个所述第一和第二串联重复核酸独立地由18至100个核苷酸碱基对组成。5.根据权利要求1所述的可切除的核酸构建体，其中每个所述第一和第二串联重复核酸独立地由18-80个核苷酸碱基对组成。6.根据权利要求1至5任意一项所述的可切除的核酸构建体，其中所述靶核酸编码选择性标记。7.根据权利要求6所述的可切除的核酸构建体，其中所述选择性标记选自下组：URA3、潮霉素B磷酸转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、博来霉素抗性基因和草胺膦N-乙酰转移酶。8.根据权利要求1至7任意一项所述的可切除的核酸构建体，其进一步包括连接至所述第一串联重复核酸5'端的第一基因组整合位点，以及连接至所述第二串联重复核酸3'端的第二整合位点。9.根据权利要求1至8任意一项所述的可切除的核酸构建体，其中所述靶核酸包含与编码F-CphI核酸内切酶的核酸可操作地连接的启动子元件。10.一种宿主细胞，其包含权利要求1至7任意一项所述的可切除的核酸构建体。11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其进一步包含包括编码F-CphI核酸内切酶的核酸的载体。12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述载体包含控制编码F-CphI核酸内切酶的核酸表达的启动子元件。13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其中所述启动子元件是诱导型启动子。14.根据权利要求1至13任意一项所述的宿主细胞，其为酵母细胞。15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其为单倍体酵母细胞。16.根据权利要求14所述的宿主细胞，其为二倍体酵母细胞。17.根据权利要求14所述的宿主细胞，其为酿酒酵母细胞。18.根据权利要求1至17任意一项所述的宿主细胞，其中所述可切除的核酸构建体整合至所述宿主细胞的基因组。19.一种从宿主细胞的基因组中切除至少一个靶核酸的方法，所述宿主细胞包括权利要求1所述的可切除的核酸构建体，其中该方法包括：在所述宿主细胞中将所述可切除的核酸构建体与F-CphI接触。2CN103228789A权利要求书2/7页20.根据权利要求19所述的方法，其中所述切除将启动子元件可操作地连接至感兴趣的基因。21.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶核酸编码选择性标记。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述选择性标记选自下组：URA3、潮霉素B磷酸转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、博来霉素抗性基因和草胺膦N-乙酰转移酶。23.根据权利要求1至22任意一项所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述宿主细胞是单倍体酵母细胞。25.根据权利要求23