用于对核酸加帽的方法和组合物.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114599795A(43)申请公布日2022.06.07(21)申请号201980099054.9(74)专利代理机构北京英赛嘉华知识产权代理(22)申请日2019.10.18有限责任公司11204专利代理师王达佐洪欣(85)PCT国际申请进入国家阶段日2022.01.30(51)Int.Cl.C12Q1/6869(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2019/0569572019.10.18(87)PCT国际申请的公布数据WO2021/076152EN2021.04.22(71)申请人加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司地址美国加利福尼亚州(72)发明人哈里·苏布拉曼尼安查德·弗莱舍丹尼斯·马利舍夫权利要求书2页说明书39页序列表2页附图14页(54)发明名称用于对核酸加帽的方法和组合物(57)摘要一种用于鉴定核酸模板的方法，其包括(a)提供多种引物‑模板杂交体，其中多种杂交体中的第一杂交体包含与第一引物杂交的第一模板，并且其中多种杂交体中的第二杂交体包含与第二引物杂交的第二模板，第二引物在3’末端具有三元复合物抑制剂部分；(b)将聚合酶和核苷酸递送至所述多种杂交体，由此第一杂交体结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物，并且由此第二杂交体不结合聚合酶和核苷酸以形成稳定的三元复合物；以及(c)检测稳定的三元复合物以鉴定第一模板。CN114599795ACN114599795A权利要求书1/2页1.一种用于对核酸中两个模板区域进行测序的方法，所述方法包括：(a)沿着核酸的第一模板区域延伸引物，从而确定所述第一模板区域的至少一部分的序列；(b)用三元复合物抑制剂部分对所述延伸的引物加帽，从而在所述核酸上形成加帽的引物‑模板杂交体；(c)将第二引物与所述核酸的第二模板区域杂交以形成包含所述加帽的引物‑模板杂交体和第二引物‑模板杂交体的核酸；以及(d)进行测序过程，其包括：(i)将所述第二杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成稳定的三元复合物；(ii)检测所述稳定的三元复合物以鉴定所述稳定的三元复合物中的核苷酸；(iii)延伸所述第二引物以在所述核酸上形成经修饰的第二杂交体；以及(iv)对所述核酸的所述经修饰的第二杂交体重复(i)、(ii)和(iii)，从而确定所述第二模板区域的至少一部分的序列。2.如权利要求1所述的方法，其中(a)包括：(i)将所述引物与所述核酸的所述模板区杂交以形成第一引物模板杂交体；(ii)将所述第一杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成所述稳定的三元复合物；(iii)检测所述稳定的三元复合物以鉴定所述稳定的三元复合物中的核苷酸；(iv)沿着所述核酸的所述第一模板区域延伸所述引物，以在所述核酸上形成经修饰的第一杂交体；以及(v)对所述核酸的所述经修饰的第一杂交体重复(ii)、(iii)和(iv)，从而确定所述第一模板区域的所述部分的所述序列。3.如权利要求2所述的方法，其中(a)(v)包括对所述核酸的所述经修饰的第一杂交体重复(ii)、(iii)和(iv)至少10次，从而确定所述第一模板的所述部分的所述序列。4.如权利要求1所述的方法，其中(a)包括在通过合成过程的测序或通过连接过程的测序中沿着所述第一模板区域延伸所述引物。5.如权利要求1所述的方法，其中(d)(iv)包括对所述核酸的所述经修饰的第二杂交体重复(i)、(ii)和(iii)至少10次，从而确定所述第二模板的部分的序列。6.如权利要求1所述的方法，其中所述延伸引物的所述加帽包括掺入包含配体的核苷酸，然后将所述配体与受体结合以形成所述三元复合物抑制剂部分。7.一种用于对核酸中两个模板区域进行测序的方法，所述方法包括：(a)提供包含第一引物‑模板杂交体和第二引物‑模板杂交体的核酸，其中所述第一杂交体包含与第一引物杂交的第一模板区，并且其中所述第二杂交体包含与第二引物杂交的第二模板，所述第二引物在所述第二引物的3’末端包含三元复合物抑制剂部分；(b)进行测序过程，其包括：(i)将所述第一杂交体与聚合酶和核苷酸结合以形成稳定的三元复合物；(ii)检测所述稳定的三元复合物以鉴定稳定的所述三元复合物中的所述核苷酸；(iii)延伸所述第一引物以在所述核酸上形成经修饰的第一杂交体；以及(iv)对所述核酸的所述经修饰的第一杂交体重复(i)、(ii)和(iii)，从而确定所述第一模板区域的至少一部分的序列；2CN114599795A权利要求书2/2页(c)用第二三元复合物抑制剂部分对所述延伸的第一引物进行加帽；(d)从所述第二引物中除去所述三元复合物抑制剂部分，同时将所述第二三元复合物抑制剂部分保留在所述第一引物上；以及(e)延伸所述第二引物，从而确定所述第二模板区域的至少一部分的序列。8