用于核酸检测的方法和组合物.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107109474A(43)申请公布日2017.08.29(21)申请号201580056516.0(74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公(22)申请日2015.08.19司72001代理人权陆军黄希贵(30)优先权数据62/0392072014.08.19US(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12N15/11(2006.01)2017.04.18(86)PCT国际申请的申请数据PCT/IB2015/0018512015.08.19(87)PCT国际申请的公布数据WO2016/027162EN2016.02.25(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人M.库比斯塔R.斯约巴克权利要求书5页说明书34页附图18页(54)发明名称用于核酸检测的方法和组合物(57)摘要提供用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法、组合物、反应混合物、试剂盒和/或系统。在一些方面，所述方法、组合物、反应混合物、试剂盒和/或系统包括使所述样品在反应混合物中在产生关于靶多核苷酸区域的完全序列的条件下经历核酸扩增反应。在一些方面，扩增所产生的互补序列。CN107109474ACN107109474A权利要求书1/5页1.用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法，所述方法包括：使所述样品在反应混合物中在产生关于靶多核苷酸区域的完全序列的条件下经历核酸扩增反应，其中所述反应混合物包含：（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列D和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）所述环引物的序列A与所述靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）所述环引物的序列B与所述靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在所述靶多核苷酸上5'至3'定向；和（b）聚合酶，其沿所述靶多核苷酸从5'至3'延伸所述环引物的序列B，所述靶多核苷酸充当用于模板引导的引物延伸的模板，以产生所述靶多核苷酸的互补序列。2.用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法，所述方法包括：使所述样品在产生关于靶多核苷酸区域的完全序列的条件下，经历具有环引物、正向引物、反向引物和聚合酶的核酸扩增反应，其中所述反应混合物包含：（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列D和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）所述环引物的序列A与所述靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）序列B与所述靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在所述靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）聚合酶，其沿所述靶多核苷酸从5'至3'延伸环引物的序列B，所述靶多核苷酸充当用于模板引导的引物延伸的模板，以产生所述靶多核苷酸的互补序列；（c）反向引物，其显示出与相对于序列A'或B'位于5'的所述靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（d）正向引物，其与和所述环引物互补的序列特异性杂交。3.权利要求1的方法，其进一步包括在反向引物和任选正向引物存在下，扩增权利要求1的产物，其中所述反向引物和所述正向引物分别显示出与所述扩增产物和所述环引物的序列互补性。4.权利要求3的方法，其中所述正向引物与所述接头序列中的序列特异性杂交。5.权利要求3的方法，其中所述反向引物与序列特异性杂交，所述序列与相对于序列A'或B'为5'的所述靶多核苷酸的一部分互补。6.权利要求2或3的方法，其进一步包括检测所述核酸扩增的产物。7.权利要求6的方法，其中所述检测步骤包括检测来自与所述产物具有序列互补性的所述反应混合物中的探针的信号。8.权利要求1或2的方法，其中序列A为长度2nt至约10nt，并且序列B为长度2nt至约10nt。9.权利要求1或2的方法，其中所述序列A和B的组合长度为约5nt至约20nt。10.权利要求1或2的方法，其中所述序列A和B的组合长度足以与所述靶多核苷酸特异性杂交，以实现所述环引物的延伸。11.权利要求1或2的方法，其中当最佳比对时，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少80%互补。12.权利要求1或2的方法，其中序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少90%互补。2CN107109474A权利要求书2/5页13.权利要求1或2的方法，其中所述序列A'的3'端在序列B'的1nt至约5nt内。14.权利要求1或2的方法，其中所述靶多核苷酸是DNA分子。15.权利要求1或2的方法，其中所述靶多核苷酸是RNA分子。16.权利要求1或2的方法，其中所述靶多核苷酸是非编码RNA分子。17.权利要求16的