一种用于检测乙酰多胺的体外检测试剂盒及其检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106381326A(43)申请公布日2017.02.08(21)申请号201610783370.6(22)申请日2016.08.31(71)申请人辽宁迈迪生物科技股份有限公司地址117004辽宁省本溪市本溪经济开发区香槐路166栋(72)发明人李文欣宫晓丽苏春阳金雪花王洪波刘峰(74)专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司21002代理人李颖周秀梅(51)Int.Cl.C12Q1/28(2006.01)C12Q1/26(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表2页附图2页(54)发明名称一种用于检测乙酰多胺的体外检测试剂盒及其检测方法(57)摘要本发明属于生物化学检测技术，特别涉及一种用于检测乙酰多胺(包括乙酰精胺、乙酰亚精胺、二乙酰精胺)的体外检测试剂盒及其检测方法。包括R1、R2试剂、标准品和质控品；其中，R1试剂与R2试剂比为1:3至3:1。本发明检测方法具有灵敏度高、操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响等优势。CN106381326ACN106381326A权利要求书1/1页1.一种用于检测乙酰多胺的体外检测试剂盒，其特征在于：包括R1、R2试剂、APAO标准品和APAO质控品；其中，R1试剂比R2试剂比为1:3至3:1。2.按权利要求1所述的用于检测乙酰多胺的体外检测试剂盒，其特征在于：所述R1试剂每升为：25-150mmol/L的KH2PO4/KOH缓冲液(pH7.6)；10-100U/mL的乙酰多胺氧化酶；1-10mmol/L的香草酸；0.01-0.1％(w/w)的叠氮化钠，余量为水；所述R2试剂每升为：25-150mmol/L的KH2PO4/KOH缓冲液(pH7.6)；0.1-5mmol/L的4-氨基安替比林；1-10U/mL的过氧化物酶；0.01-0.1％(w/w)的叠氮化钠，余量为水。3.按权利要求1所述的用于检测乙酰多胺的体外检测试剂盒，其特征在于：所述标准品为乙酰多胺纯品；质控品为乙酰多氨纯品或含乙酰多氨的样本或溶液。4.按权利要求1所述的用于检测乙酰多胺的体外检测试剂盒，其特征在于：所述乙酰多胺氧化酶为将产乙酰多胺氧化酶酶(APAO)的重组大肠杆菌BL21接种于种子培养基中，于30～37℃振荡培养8～12h，而后将种子培养液按体积比3～10％的接种量接种至表达培养基，于30～37℃振荡培养4～6h小时；而后再于20～30℃振荡诱导培养14～22h，培养液经离心后收集上清液，即为胞外粗提重组酶APAO；沉淀离心后收集菌体细胞沉淀并超声破碎，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗提重组酶APAO；将获得胞外和胞内粗提重组酶经纯化，即可。5.按权利要求4所述的用于检测乙酰多胺的体外检测试剂盒，其特征在于：所述产乙酰多胺氧化酶酶(APAO)的重组大肠杆菌BL21为将经密码子优化的乙酰多胺氧化酶酶(APAO)基因(SEQIDNo.1)两端进行修饰，而后与pET-22b(+)载体连接，连接后转化到大肠杆菌感受态细胞，得到重组大肠杆菌，待用。6.按权利要求4所述的用于检测乙酰多胺的体外检测试剂盒，其特征在于：所述表达培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～11g，酵母粉5～24g，MgCl20～0.83g，KCl0～0.186g，ZnCl20～0.186g，50％的甘油0～20wt％，50％的蔗糖0～20％，50％的葡萄糖0～20wt％，精氨酸0～10mM，半胱氨酸0～10mM，其余成分为0.25mol/LTris-HCl。7.按权利要求4所述的用于检测乙酰多胺的体外检测试剂盒，其特征在于：所述将种子培养液接种至表达培养基中振荡培养后，向表达培养基中中加入诱导剂，而后再于20～30℃振荡诱导培养14～22h；其中，诱导剂添加量为每升所述表达培养基0～5g，其中诱导剂为IPTG或乳糖。8.一种权利要求1所述的利用用于检测乙酰多胺的体外检测试剂盒检测的方法，其特征在于：通过检测乙酰多胺氧化酶(APAO)和乙酰多胺反应后产物H2O2的变化量对样本中乙酰多胺进行检测。2CN106381326A说明书1/7页一种用于检测乙酰多胺的体外检测试剂盒及其检测方法技术领域[0001]本发明属于生物化学检测技术，特别涉及一种用于检测乙酰多胺(包括乙酰精胺、乙酰亚精胺、二乙酰精胺)的体外检测试剂盒及其检测方法。技术背景[0002]多胺是一类具有两个或多个氨基的有机化合物，包括精胺、腐胺、尸胺等，广泛存在于各类生物体中。多胺可以通过与带负电荷的生物大分子结合，影响DNA复制、转录和蛋白质的功能，从而广泛参与细胞增殖、分化和胚胎发育等多种重要生命活动过程。乙酰化的多胺称为乙酰多胺(acetylpolyamine)，包括乙酰精胺(N1