一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113406330A(43)申请公布日2021.09.17(21)申请号202110736491.6(22)申请日2021.06.30(71)申请人军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所地址300050天津市和平区大理道1号(72)发明人宁保安孙铁强韩振宇姚站馨高蔚娜张予弦陈宗粉杨涵郭长江(74)专利代理机构北京丰浩知识产权代理事务所(普通合伙)11781代理人董亚男(51)Int.Cl.G01N33/58(2006.01)G01N33/543(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图8页(54)发明名称一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法(57)摘要本发明涉及食品安全检测免疫分析技术领域，更具体地，涉及一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法。试剂盒包括：诺氟沙星‑生物素标记物、诺氟沙星多克隆抗体、修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶、金纳米粒子、抗坏血酸磷酸、硫酸铜溶液和铜离子探针，金纳米粒子包括连接有叠氮基的金纳米粒子和连接有炔基的金纳米粒子。本发明技术具有灵敏度高、检测范围宽、操作简单、特异性好等优点，对诺氟沙星的超灵敏检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏侦检技术具有很好的指导意义。CN113406330ACN113406330A权利要求书1/2页1.一种用于检测诺氟沙星的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(1)诺氟沙星‑生物素标记物；(2)诺氟沙星多克隆抗体；所述诺氟沙星多克隆抗体包被于多孔板上；(3)修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶；(4)金纳米粒子；所述金纳米粒子包括连接有叠氮基的金纳米粒子和连接有炔基的金纳米粒子，所述金纳米粒子用于检测一价铜离子；(5)抗坏血酸磷酸；(6)硫酸铜溶液；(7)铜离子探针；所述铜离子探针用于检测二价铜离子；所述诺氟沙星‑生物素标记物用于与所述诺氟沙星多克隆抗体结合，且用于与所述修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶结合；所述修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶用于还原所述抗坏血酸磷酸为抗坏血酸，所述抗坏血酸用于将所述硫酸铜溶液中的二价铜离子还原为一价铜离子。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述金纳米粒子的直径为13～17nm；优选的，所述连接有叠氮基的金纳米粒子和所述连接有炔基的金纳米粒子的摩尔比为1：1；更优选的，所述金纳米粒子的浓度为0.5～2OD。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述诺氟沙星‑生物素标记物中，每1mg诺氟沙星上标记有生物素0.02～0.06mg；优选为0.04mg；优选的，所述诺氟沙星‑生物素标记物的浓度为0.6～1mg/mL，优选为0.8mg/mL；更优选的，所述诺氟沙星‑生物素标记物保存于甲醇中。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多孔板上诺氟沙星多克隆抗体包被量为50～200μg/孔，优选为100μg/孔。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，抗坏血酸磷酸的浓度为1～3mM，优选2mM。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，硫酸铜溶液的浓度为1～3mM，优选为2mM；优选的，铜离子探针的浓度为10～30μM，优选为20μM，保存于pH＝7.2的Tris‑HCl：CH3CN体积比为1:1的混合溶剂中。7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有诺氟沙星标准品；优选的，所述诺氟沙星标准品的浓度为10‑6pg/mL～107pg/mL；更优选的，所述诺氟沙星标准品采用稀释液配制得到，所述稀释液为含有体积百分比为10％甲醇的1XPBS缓冲液。8.根据权利要求1～7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述铜离子探针用于输出荧光信号；所述金纳米粒子用于输出可视化信号。9.一种诺氟沙星的检测方法，其特征在于，采用权利要求1～8任一项所述的试剂盒进行检测，至少包括以下步骤：S1、将诺氟沙星多克隆抗体包被于多孔板上；所述多孔板上诺氟沙星多克隆抗体包被量为50～200μg/孔，优选为100μg/孔；2CN113406330A权利要求书2/2页S2、将检测诺氟沙星标准品每个梯度浓度各50μL和诺氟沙星‑生物素标记物50μL混合，加入到多孔板上，36～38℃条件反应45～75分钟，优选60分钟；S3、加入修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶100μL体积，36～38℃条件反应20～40分钟，优选分钟；S4、加入抗坏血酸磷酸100μL，36～38℃条件反应45～75分钟，优选60分钟；S5、加入硫酸铜溶液100μL，室温条件反应7～15分钟，优选10分钟；S6、取100μL加入铜离子探针100μL，检测荧光信号，并绘制标准曲线，取50μL加入金纳米粒子混合液160μL体积，检测可视化信号，并制备颜色变化图；S7、将检测得到的各梯度浓度荧光信号绘制标准曲线