一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒及其检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107085110A(43)申请公布日2017.08.22(21)申请号201710399343.3(22)申请日2017.05.31(71)申请人江西乐成生物医疗有限公司地址334000江西省上饶市上饶经济技术开发区聚远路26号(72)发明人余跃飞王小中黄龙(51)Int.Cl.G01N33/574(2006.01)G01N33/531(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图3页(54)发明名称一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒及其检测方法(57)摘要本发明公开了一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒及其检测方法，包括捕获抗体，所述捕获抗体是L选择素（L-SELECTIN）制得的单克隆抗体；所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体为L选择素制得的多克隆抗体。本发明利用L选择素在肿瘤细胞表面的高表达，是一种新型恶性肿瘤高特异性的分子标记物，具有灵敏度高准确性强的特点，其灵敏度及准确性均达到65%以上。CN107085110ACN107085110A权利要求书1/2页1.一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒，其特征在于，包括捕获抗体，所述捕获抗体是L选择素制得的单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体的制备方法包括的步骤如下：S1：抗原的制备；把L选择素的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原；S2：捕获抗体的制备；将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。3.根据权利要求1所述的一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体为L选择素制得的多克隆抗体。4.根据权利要求3所述的一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒，其特征在于，所述检测抗体的制备方法包括的步骤如下：S1：抗原的制备；把L选择素的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原；S2：检测抗体的制备；将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体。5.根据权利要求1或2所述的一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体预先包被于微量滴定板的孔内。6.一种根据权利要求5所述的用于甲状腺癌体外诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：抗原的制备：将L选择素基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原；S2：捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；S3：检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；S4：捕获抗体包被：S4.1：用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；S4.2：封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；S4.3：弃去包被液，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μlPBST，除去洗涤液和剩余的液滴，晾干放于4℃环境中；S5：封闭：每孔添加200μl封闭缓冲液，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。7.一种根据权利要求5所述的用于甲状腺癌体外诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：抗原的制备：将L选择素基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达；S2：捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；S3：检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；S4：捕获抗体包被：2CN107085110A权利要求书2/2页S4.1：用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；S4.2：封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；S4.3：弃去包被液，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μlPBST，除去洗涤液和剩余的液滴，晾干放于4℃环境中；S5：封闭：S5.1：在微量滴定板的每个孔添加200μl封闭缓冲液，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；S5.2：封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；S6：加样：S6.1：将100μl样品添加到每个孔，在37℃孵育60分钟；S6.2：弃去样品，并洗涤微量滴定板三次，每次在微孔中加入200μlPBST；S6.3：将100μl浓度为0.5μg/ml的检测抗体添加到每个孔；S6.4：封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；S6.5：用PBST洗涤微量滴定板四次；S6.6：添加100μl标记二抗；S6.7：封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；S6.8：用PBST洗涤微量滴定板四次；S7：检测：S7.1：将TMB溶液添加到每个孔，孵育15-30分钟，添加等体积的