Ssm6a的重组表达和纯化方法及其使用的融合蛋白.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108117599A(43)申请公布日2018.06.05(21)申请号201810004866.8C12N15/70(2006.01)(22)申请日2018.01.03C12N1/21(2006.01)C12P21/06(2006.01)(71)申请人海门迈克艾伦生物医药有限公司C12R1/19(2006.01)地址226100江苏省南通市海门市临江镇洞庭湖路100号A6楼2楼(72)发明人原桂勇殷海兴王凯健朱冠军谭莹莹(74)专利代理机构北京市中咨律师事务所11247代理人凌立黄革生(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C07K1/22(2006.01)C07K1/18(2006.01)C12N15/62(2006.01)权利要求书3页说明书11页序列表2页附图2页(54)发明名称Ssm6a的重组表达和纯化方法及其使用的融合蛋白(57)摘要本发明涉及多肽的重组表达和纯化，尤其涉及氨基酸数目较多且富含二硫键的多肽的大规模重组表达和纯化。本发明提供一种分子伴侣-纯化标签-内切酶切割位点-毒素多肽Ssm6a的融合蛋白，其包含SEQIDNO:1及其变体的氨基酸序列。本发明还提供一种重组表达和纯化来源于少棘蜈蚣毒液的毒素多肽Ssm6a的方法。CN108117599ACN108117599A权利要求书1/3页1.一种融合蛋白，包含分子伴侣和毒素多肽Ssm6a，其特征在于所述分子伴侣促进毒素多肽Ssm6a中二硫键的正确折叠，使最终得到的成熟毒素多肽Ssm6a具有天然生物活性。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于从N端至C端包含分子伴侣、纯化标签、内切酶切割位点和毒素多肽Ssm6a。3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于所述分子伴侣是硫氧还蛋白；所述纯化标签是6-10个组氨酸(His-Tag)；优选是6个组氨酸；所述内切酶是肠激酶；所述毒素多肽Ssm6a包含下述氨基酸序列之一或由下述氨基酸序列之一组成:(1)如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；(2)由SEQIDNO:4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(3)与SEQIDNO:3所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；(4)在SEQIDNO:3所示的氨基酸序列中的一处或多处具有氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列；和(5)由下述核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列因遗传密码子的简并性而不同于SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。4.如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的氨基酸序列包含下述氨基酸序列之一或由下述氨基酸序列之一组成:(1)如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；(2)由SEQIDNO:2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(3)与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；(4)在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列中的一处或多处具有氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列；和(5)由下述核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列因遗传密码子的简并性而不同于SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。5.如权利要求3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述毒素多肽Ssm6a的氨基酸序列包含与SEQIDNO:3所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列，或由与SEQIDNO:3所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列组成；所述融合蛋白的氨基酸包含与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列，或由与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列组成。6.如权利要求3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述一处或多处氨基酸的取代、缺失或插入是至多5处氨基酸的取代、缺失或插入，其中所述至多5处氨基酸的取代优选是至多5处保守氨基酸的取代。7.如权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白，其特征在于所述毒素多肽Ssm6a来源于少棘蜈蚣毒液。8.编码权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列，其包含下述核苷酸序列2CN108117599A权利要求书2/3页之一或由下述核苷酸序列之一组成:(1)如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列；(2)编码权利要求1-7中任一项的融合蛋白的核苷酸序列；(3)核苷酸序列，其在严格杂交条件下与(1)或(2)所述的核苷酸序列杂交且编码具有SEQIDNO