Fc融合蛋白及其纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112876567A(43)申请公布日2021.06.01(21)申请号201911218713.4(22)申请日2019.11.29(71)申请人广东菲鹏制药股份有限公司地址523808广东省东莞市松山湖园区桃园路1号10栋301室(72)发明人霍永庭刘恒嘉芦迪刘云鹏(74)专利代理机构北京超凡宏宇专利代理事务所(特殊普通合伙)11463代理人徐乐(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C07K1/18(2006.01)权利要求书1页说明书10页附图6页(54)发明名称Fc融合蛋白及其纯化方法(57)摘要本发明涉及蛋白纯化领域，具体而言，提供了一种Fc融合蛋白及其纯化方法。本发明提供的Fc融合蛋白的纯化方法，待纯化样本经离子交换纯化，得到Fc融合蛋白，其中，离子交换纯化缓冲液中含有添加剂，所述添加剂包括脯氨酸、组氨酸或天冬氨酸中的至少一种。发明人研究发现添加剂抑制纯化过程中聚集体的产生，有效地解决了Fc融合蛋白的聚集问题，显著提高了产品的回收率。CN112876567ACN112876567A权利要求书1/1页1.一种Fc融合蛋白的纯化方法，其特征在于，待纯化样本经离子交换纯化，得到Fc融合蛋白；离子交换纯化缓冲液中含有添加剂，所述添加剂包括脯氨酸、组氨酸或天冬氨酸中的至少一种。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，添加剂包括脯氨酸、组氨酸和天冬氨酸。3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述脯氨酸、组氨酸或天冬氨酸的浓度均独立地为0.05-0.4mol/L。4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，纯化后的Fc融合蛋白在保存液中保存，所述保存液中含有保护剂，所述保护剂包括脯氨酸和/或组氨酸。5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述组氨酸的浓度为0.05-0.3mol/L；优选地，所述脯氨酸的浓度为0.1-0.3mol/L。6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，离子交换纯化包括阳离子交换层析或阴离子交换层析，优选为阳离子交换层析，进一步优选为CapoMMC。7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，待纯化样本经捕获纯化后再进行离子交换纯化；优选地，所述捕获纯化的方法包括亲和层析，优选为ProteinA亲和层析。8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，待纯化样本经离子交换纯化后，再进行精细纯化，得到Fc融合蛋白；优选地，所述精细纯化的方法包括凝胶过滤层析。9.根据权利要求1-8任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述待纯化样本包括细胞发酵液，优选为抗CD40抗体与CTLA-4的融合蛋白细胞发酵液。10.权利要求1-9任一项所述的纯化方法得到的纯化后的Fc融合蛋白。2CN112876567A说明书1/10页Fc融合蛋白及其纯化方法技术领域[0001]本发明涉及蛋白纯化领域，具体而言，涉及一种Fc融合蛋白及其纯化方法。背景技术[0002]Fc融合蛋白是基于抗体结构改造的双功能融合蛋白，是在传统抗体的C端，即重链CH3端，通过合适的linker连接一段功能蛋白分子。构建好的双功能融合蛋白可以通过抗体的Fab和融合的功能蛋白起到双重或多重生物功能，在制药、诊断领域具有广阔应用前景。[0003]目前，单克隆抗体的平台工艺已经比较成熟，由于抗体以及Fc融合蛋白有相似的分子结构，所以在Fc融合蛋白的研发以及设计生产工艺的时候往往会参照抗体的平台工艺。其中，抗体的纯化中首先通过ProteinA对发酵料液中目标抗体进行捕获，然后使用1-2步的离子交换层析进一步提高蛋白纯度，以达到不同产品的纯度、质量需求。在目前技术条件下，该纯化平台是最有利于抗体类蛋白纯化制备的。而在保留Fc片段情况下对抗体进行改造所产生的各种Fc融合蛋白，一般也都直接参考该方式进行纯化。然而问题在于，改造后的Fc融合蛋白往往都没有抗体稳定，包括双功能融合蛋白，不同的融合形式，可能会有不同的纯化制备问题，比如：表达量低导致产量少，进而导致生产制备成本高昂；产品对酸敏感，导致酸洗脱后样品容易沉淀、聚集和降解，进而导致纯化工艺开发困难；产品结构不稳定，相比于抗体制剂配方难以开发等等。这些问题会在技术、成本上制约双功能融合蛋白的开发。在纯化工艺中，Fc融合蛋白本身性质的不稳定往往导致Fc融合蛋白会不均匀的吸附在层析填料上，产生局部高浓度区域，随着上样载量提高，这种局部的高浓度会导致蛋白粘度提高，当蛋白不稳定时，将更容易形成聚集体的问题。[0004]有鉴于此，特提出本发明。发明内容[0005]本发明的第一目的在于提供一种Fc融合蛋白的纯化方法，以缓解现有技术中Fc融合蛋白纯化易发生蛋白聚集，产品回收率低，导致成本升高的问题。[0006]本发明的第