人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114150010A(43)申请公布日2022.03.08(21)申请号202111289460.7C12R1/19(2006.01)(22)申请日2021.11.02(71)申请人安徽医科大学地址230032安徽省合肥市蜀山区梅山路81号(72)发明人刘超陈雪莹刘丽华(74)专利代理机构合肥天明专利事务所(普通合伙)34115代理人张梦媚(51)Int.Cl.C12N15/70(2006.01)C07K19/00(2006.01)C07K1/22(2006.01)C07K1/14(2006.01)G01N33/68(2006.01)权利要求书2页说明书7页序列表10页附图2页(54)发明名称人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法及应用(57)摘要本发明公开了一种人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法及应用，包括：构建人BAF45D原核表达载体，获得重组质粒pGEX‑5X‑1‑BAF45D；GST‑BAF45D融合蛋白的原核表达：将所述重组质粒pGEX‑5X‑1‑BAF45D转入Rosetta(DE3)大肠杆菌，经IPTG诱导表达，获得菌体沉淀；破碎细菌，收集上清；GST‑BAF45D融合蛋白的纯化：将经过原核表达获得的上清经GSTResin离心纯化。该方法可实现菌体的高效表达，并获得高活性的GST‑BAF45D融合蛋白，从而能够将其与人胚胎干细胞裂解总蛋白结合孵育，可简便的筛选出与目的蛋白结合的人胚胎干细胞来源的蛋白，具有实际应用价值。CN114150010ACN114150010A权利要求书1/2页1.一种人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：构建人BAF45D原核表达载体，获得重组质粒pGEX‑5X‑1‑BAF45D；GST‑BAF45D融合蛋白的原核表达：将所述重组质粒pGEX‑5X‑1‑BAF45D转入Rosetta(DE3)大肠杆菌，经IPTG诱导表达，获得菌体沉淀；破碎细菌，收集上清；GST‑BAF45D融合蛋白的纯化：将经过原核表达获得的上清经GSTResin离心纯化。2.如权利要求1所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述IPTG诱导表达的参数为：采用终浓度为0.3mMIPTG，30℃、250rpm震荡培养诱导表达5h。3.如权利要求1所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述IPTG诱导表达的步骤，具体为：挑取已转入质粒大肠杆菌菌种GST‑BAF45D‑Rosseta接种于LB液体培养基中，震荡过夜，获得过夜培养物；将所述过夜培养物接种到LB液体培养基中，震荡培养至OD600＝0.4‑0.8后，加入100mMIPTG至终浓度为0.3mM，30℃、250rpm震荡培养诱导表达5h后，离心培养物，弃去上清，获得菌体沉淀。4.如权利要求1所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述破碎细菌的步骤，具体为：预冷细菌裂解液，以100mL菌液沉淀比6‑8mL细菌裂解液的比例将菌体沉淀悬起，收集后进行冰浴超声破碎细菌，收集上清。5.如权利要求4所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述细菌裂解液的组成为50mMTris、1mMEDTA、1％TritonX100、5mMDTT、2mMPMSF，pH＝8。6.如权利要求4所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述超声的参数具体为：40％‑60％功率425W，超声4s，停8s，工作4‑6min。7.如权利要求1所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述GSTResin离心纯化的步骤，具体为：取30‑50μLGSTResin与1500‑2000μLGST‑BAF45D‑Rosseta细菌裂解的GST‑BAF45D总蛋白，4℃孵育3小时，收集沉淀；使用1000‑2000μL细菌裂解液洗杂质蛋白，在冰上振摇5min,收集沉淀；重复清洗杂质蛋白3次，收集沉淀，获得纯化后的GST‑BAF45D融合蛋白。8.一种寻找并鉴定人胚胎干细胞来源的真核蛋白的结合蛋白的方法，其特征在于，包括下列步骤：提供纯化的GST‑BAF45D融合蛋白，其采用如权利要求1‑7任一项所述的人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法获得；采用GST‑pulldown方法将所述GST‑BAF45D纯化蛋白与人胚胎干细胞来源的真核总蛋白结合，寻找鉴定人胚胎干细胞来源的结合蛋白。9.如权利要求8所述的寻找并鉴定人胚胎干细胞来源的真核蛋白的结合蛋白的方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞来源的真核总蛋白选自H9细胞蛋白、NCCIT细胞蛋白或纯化后的His‑SMAD3蛋白。10.如权利要求8所述的寻找并鉴定人胚胎干细胞来源的真核蛋白