结核分枝杆菌融合蛋白LT29构建及其表达纯化方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112979825A(43)申请公布日2021.06.18(21)申请号202110155163.7C07K1/18(2006.01)(22)申请日2021.02.04C07K1/14(2006.01)A61K39/04(2006.01)(71)申请人兰州大学A61K39/39(2006.01)地址730000甘肃省兰州市城关区天水南A61P31/06(2006.01)路222号(72)发明人祝秉东马岩林张艺凡石新彤杜秀芬谭大权牛红霞李菲龚洋(74)专利代理机构北京中誉威圣知识产权代理有限公司11279代理人赵莎莎(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C12N15/70(2006.01)C07K1/20(2006.01)权利要求书2页说明书15页序列表3页附图4页(54)发明名称结核分枝杆菌融合蛋白LT29构建及其表达纯化方法和应用(57)摘要本发明公开了结核分枝杆菌融合蛋白LT29的表达纯化方法，将结核分枝杆菌活动期抗原EAST6和结核分支杆菌潜伏期抗原Rv2626c进行融合，中间以柔性肽段连接，构建了融合蛋白ESAT6‑linker‑Rv2626c。将该融合蛋白在大肠埃希菌B21工程菌中进行表达纯化，与佐剂DP联合构建结核亚单位疫苗。该融合蛋白在大肠杆菌中成功得到表达纯化；在小鼠体内可以诱导产生较强的针对结核杆菌特定抗原(ESAT6和Rv2626c)的特异性细胞免疫反应，并促进较长期的记忆性T细胞的产生，具有较强的免疫原性。本发明成功构建、表达和纯化了不带标签的新型融合蛋白LT29，该蛋白融合了结核菌活动期抗原和潜伏期抗原，可诱导产生抗原特异性细胞免疫和体液免疫，有望成为结核病预防和治疗的有效候选疫苗。CN112979825ACN112979825A权利要求书1/2页1.结核分枝杆菌融合蛋白LT29的构建及表达纯化方法，其特征在于，首先将结核分枝杆菌活动期抗原EAST6和结核分支杆菌潜伏期抗原Rv2626c进行基因水平的融合，构建重组载体pET30a(+)‑LT29；构建好的pET30a‑Rv2626c质粒，在Rv2626c基因前面插入ESAT6基因，在ESAT6下游引物中加入一段linker(GGGGS)3，构成了重组质粒pET30a(+)‑LT29(pET30a(+)‑ESAT6‑linker‑Rv2626c)；然后，将pET30a(+)‑LT29质粒载体转化入大肠杆菌E.coli中进行融合蛋白LT29的表达；最后，根据该蛋白的蛋白特性，通过盐析、疏水层析与离子层析相结合的方法纯化该融合蛋白。2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白LT29的构建及表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建重组基因载体pET30a(+)‑LT29(ESAT6‑linker‑Rv2626c)根据pET30a‑Rv2626c、pET30a‑ESAT6重组基因序列，设计引物扩增ESAT6基因片段；引物分别为：上游引物：CGCCATATGATGATGACAGAGCAGCAG，其中斜体为NdeⅠ限制性酶切位点；下游引物：CGAGCTCGAGACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCTGCGAACATCCCA，CGAGCTCGAGACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCTGCGAACATCCCA，其中斜体为SacⅠ限制性酶切位点，下划线部分为linker；以pET30a(+)‑Rv2626c质粒为载体，用上述两条引物，PCR扩增出EAST6‑linker基因产物；该PCR产物经纯化后，用NdeⅠ和SacⅠ进行双酶切，克隆构建在质粒pET30(+)a‑Rv2626c上，构建成pET30a(+)‑LT29(ESAT6‑linker‑Rv2626c)载体；2)新型融合蛋白LT29的表达将构建成功的pET30a(+)‑LT29(ESAT6‑linker‑Rv2626c)载体转化入表达载体大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中；活化表达EAMMH蛋白的E.coliBL‑21(DE3)菌体，取1ml活化后菌体加入200mlLB培养基中37℃震荡培养4h；加入蛋白诱导剂IPTG(1.0mmol/L)100ul，29℃诱导振荡培养12h；4℃10000G离心10min收集菌体；菌体重悬于PB缓冲液(Na2HPO4·12H2O20mMol/L，Na2HPO4·12H2O20mMol/L，pH7.4)10ml/g湿菌，冰浴下超声破碎细菌0.5h(180～200W,超声3s停3s)；10000G离心15min后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；3)新型