纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113880908A(43)申请公布日2022.01.04(21)申请号202110983902.1C07K1/36(2006.01)(22)申请日2021.08.25C07K1/14(2006.01)(71)申请人北京伟德杰生物科技有限公司地址100085北京市海淀区开拓路5号1层B区B102(72)发明人成健伟李绍奎田新生李自强张筠(74)专利代理机构北京睿阳联合知识产权代理有限公司11758代理人王莹景鹏(51)Int.Cl.C07K1/30(2006.01)C07K1/18(2006.01)C07K1/20(2006.01)C07K1/34(2006.01)权利要求书1页说明书9页附图7页(54)发明名称纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法(57)摘要本发明公开了纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：将所述融合蛋白上清液依次经过酸化沉淀、阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析进行精细纯化，基本上去除融合蛋白中的工艺相关杂质和产品相关杂质，可获得符合药学研究的高质量产品，有效地解决了大规模生产时蛋白纯度低、收率低的问题。CN113880908ACN113880908A权利要求书1/1页1.纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法，包括以下步骤：将含有所述融合蛋白的细胞培养上清液用酸性溶液调节pH至酸性，进行酸化沉淀，过滤获得酸化上清液；将获得的所述酸化上清液进行阳离子交换层析，获得第一洗脱液；经病毒灭活后，将所述第一洗脱液进行阴离子交换层析，获得第二洗脱液；将所述第二洗脱液进行疏水层析，获得含有所述融合蛋白的溶液。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述融合蛋白还包含细胞因子；优选地，所述细胞因子为白介素2。3.根据权利要求1所述的方法，其中，在酸化沉淀前，向所述细胞上清液中加入钙离子；优选地，所述钙离子为钙盐的形式；更优选地，所述钙盐为氯化钙。4.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述酸化沉淀中，所述酸性溶液选自磷酸、盐酸、醋酸和柠檬酸中的一种或多种；优选地，所述酸性溶液为磷酸。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述阳离子交换层析的层析介质为含磺丙基配基的介质；优选地，所述阳离子交换层析中的平衡缓冲液的pH为5.0‑6.0；优选地，所述阳离子交换层析中的洗脱缓冲液的pH为5.0‑6.0。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述病毒灭活为在稳定剂的存在下使用酸性溶液调节所述第一洗脱液的pH至酸性，然后用碱性溶液中和至中性。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述稳定剂选自糖、氨基酸、糖醇和氧化还原剂中的一种或多种；优选地，所述稳定剂为糖和糖醇；更优选地，所述稳定剂为蔗糖和山梨糖醇。8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述病毒灭活中所述酸性溶液选自磷酸、盐酸、醋酸和柠檬酸中的一种或多种，优选为磷酸；和/或，所述碱性溶液选自氢氧化钠、Tris和醋酸钠中的一种或多种，优选为Tris‑HCl溶液。9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述阴离子交换层析的层析介质为含季铵基配基的介质；优选地，所述阴离子交换层析中的平衡缓冲液的pH为6.0‑8.0；优选地，所述阴离子交换层析中的洗脱缓冲液的pH为6.0‑8.0。10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述疏水层析的层析介质为含苯基配基的介质，优选地，所述疏水层析中的平衡缓冲液的pH为6.0‑8.0；优选地，所述疏水层析中的洗脱缓冲液的pH为6.0‑8.0。2CN113880908A说明书1/9页纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法技术领域[0001]本发明属于生物医药纯化方法领域，具体涉及用于纯化哺乳动物细胞表达重组人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的方法。背景技术[0002]人血清白蛋白(HSA)占血清总蛋白含量一半及以上，是血液循环中的一个非常重要的天然蛋白。分子量为66KDa，正常情况下不能被肾小球滤过，在血清中半衰期达3周左右，内环境相容性好，免疫原性低。经研究表明，使用人血清白蛋白作为一种载体，将治疗性蛋白或多肽与人血清白蛋白融合所表达的融合蛋白既保持原有蛋白或多肽的生物活性，也明显降低药物在体内的清除速率，从而延长药物半衰期，大大减少了病人给药频率，提高病人的顺应性。[0003]白介素2(IL‑2)是趋化因子家族的一种细胞因子。主要是由T淋巴细胞产生，能激活T细胞，促进B细胞分化及分泌抗体，对机体免疫应答和抗肿瘤、抗病毒感染等有重要作用，是一种天然的免疫增强剂。当前，临床上批准使用的白介素2主要用于治疗癌症(转移性肾癌、黑色素癌)和自身免疫疾病。然而，至今没有得到实质性及突破性的进展，主要原因可能是自身血浆半衰期较短，在体内仅为数分钟，很难达到一个稳定的有效血浆浓度，也就达不到