用于纯化双链核酸的方法和组合物.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109661467A(43)申请公布日2019.04.19(21)申请号201780055280.8(74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公司720(22)申请日2017.09.1201代理人权陆军杨思捷(30)优先权数据62/3933312016.09.12US(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12Q1/6806(2018.01)2019.03.08(86)PCT国际申请的申请数据PCT/EP2017/0728312017.09.12(87)PCT国际申请的公布数据WO2018/046748EN2018.03.15(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人P.贝拉雷C.霍尔库姆A.卡西拉T.赫里斯Q.阮K.坎帕尼I.科茨洛夫权利要求书1页说明书10页(54)发明名称用于纯化双链核酸的方法和组合物(57)摘要本文提供了在磁性玻璃颗粒上有效地分离短双链核酸的方法和组合物。CN109661467ACN109661467A权利要求书1/1页1.用于回收与磁性玻璃珠粒(MGP)非共价结合的双链核酸的自动化方法，其包括：a)将磁场施加至盛放溶液中的与MGP非共价结合的双链核酸的容器，并去除未与MGP结合的液体；b)在低于50℃的温度下在所述容器中使与MGP非共价结合的双链核酸与洗脱缓冲液接触；c)将磁场施加至所述容器；d)收集未与MGP结合的液体，由此收集洗脱物；e)在低于50℃的温度下在所述容器中使与MGP非共价结合的双链核酸与洗脱缓冲液接触；f)将磁场施加至所述容器；和g)收集未与MGP结合的液体，由此收集洗脱物；其中步骤d)和g)中收集的洗脱物包含从MGP回收的双链核酸。2.权利要求1的自动化方法，其中步骤b)和e)中的温度为25℃至47℃。3.权利要求1或2的自动化方法，其中所述双链核酸长度为50-500个碱基对。4.权利要求1-3中任一项的自动化方法，其中所述双链核酸来自选自血液、血浆、血清、羊水、脑脊液和尿液的样品。5.权利要求1-4中任一项的自动化方法，其中步骤a)中的所述溶液具有小于7的pH。6.权利要求1-5中任一项的自动化方法，其中步骤a)中的所述溶液具有小于6.5的pH。7.权利要求1-6中任一项的自动化方法，其中所述洗脱缓冲液具有大于7的pH。8.权利要求1-7中任一项的自动化方法，其中步骤d)和g)中收集的所述洗脱物中的核酸包含至少50%双链核酸。9.权利要求1-8中任一项的自动化方法，其在步骤a)之前进一步包括：在容器中使含有双链核酸的液体样品与MGP接触，由此在所述容器中允许双链核酸非共价结合溶液中的MGP；将磁场施加至所述容器，并去除未与MGP结合的液体，由此留下与MGP非共价结合的双链核酸；和将液体添加至与MGP非共价结合的双链核酸。10.权利要求1-9中任一项的自动化方法，其中在步骤b)和e)中使所述洗脱缓冲液和与MGP非共价结合的双链核酸接触至少5分钟。11.权利要求1-10中任一项的自动化方法，其中在步骤b)和e)中使所述洗脱缓冲液和与MGP非共价结合的双链核酸接触5-25分钟。12.权利要求1-11中任一项的自动化方法，其中使用自动化移液器将洗脱缓冲液和与MGP非共价结合的双链核酸混合。2CN109661467A说明书1/10页用于纯化双链核酸的方法和组合物[0001]发明背景磁性玻璃珠粒方便地用于核酸纯化。最近，已经聚焦于从以微创或非侵入性方式(例如从血液、唾液、尿液等)获得的样品中获得核酸。这些样品中的无细胞核酸(cfNAs)可以包括相对短的多核苷酸，例如，小于100或1000bp，所述多核苷酸不能使用标准结合和洗脱条件用磁性玻璃珠粒有效地回收。此外，使用标准条件获得的双链cfNA（其对于一些分析技术是必需的）不足。[0002]发明概述本文提供了用于从磁性玻璃珠粒(MGP)自动回收双链核酸的方法和组合物。所述方法包括使用两次或更多次低温洗脱来从MGP洗脱与MGP非共价结合的双链核酸。在一些实施方案中，所述方法包括a)将磁场施加至盛放溶液(例如，包含洗涤缓冲液或具有结合缓冲液的样品)中的与MGP非共价结合的双链核酸的容器，并去除未与MGP结合的液体；b)在低于70℃(例如，25-60℃、25-50℃、30-45℃、32℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、60℃、65℃)的温度下在容器中使与MGP非共价结合的双链核酸与洗脱缓冲液接触；c)将磁场施加至容器；d)收集未与MGP结合的液体，由此收集洗脱物；e)在低于50℃的温度下在容器中使与MGP非共价结合的双链核酸与洗脱缓冲液接触；f)将磁场施加至容器；和g)收集未与M