用于对双链核酸进行测序的方法和组合物.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115516104A(43)申请公布日2022.12.23(21)申请号202180032682.2布列塔尼·A·罗曼法比安布洛克(22)申请日2021.03.03·(74)专利代理(30)优先权数据机构北京安信方达知识产权代理62/984,4382020.03.03US有限公司11262专利代理师李敏春郑霞(85)PCT国际申请进入国家阶段日2022.11.02(51)Int.Cl.C12Q1/6806(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据C12Q1/6837(2006.01)PCT/US2021/0205642021.03.03(87)PCT国际申请的公布数据WO2021/178467EN2021.09.10(71)申请人加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司地址美国加利福尼亚州(72)发明人库尔特·帕特森权利要求书9页说明书44页哈里·K·K·苏布拉马尼安序列表3页附图28页(54)发明名称用于对双链核酸进行测序的方法和组合物(57)摘要一种用于从核酸的有义链和反义链确定序列的方法，包括(a)提供附接到固体支持物的核酸簇，其中核酸簇包含串联体的有义链和反义链，串联体包含序列单元的多于一个拷贝，序列单元包含靶序列和引物结合位点；(b)将引物与反义链中的引物结合位点杂交；(c)沿着反义链延伸引物以从反义链中靶序列的至少一部分确定序列；(d)将第二引物与有义链中的引物结合位点杂交；以及(e)沿着有义链延伸第二引物以从有义链中靶序列的至少一部分确定序列。CN115516104ACN115516104A权利要求书1/9页1.一种组合物，包含固体支持物，所述固体支持物附接有核酸簇，所述核酸簇包含串联体的有义链和所述串联体的反义链，其中所述串联体包含串联连接的序列单元的多于一个拷贝，其中所述序列单元包含靶序列和引物结合位点，任选地其中所述有义链共价附接到所述固体支持物，并且任选地其中所述反义链共价附接到所述固体支持物。2.根据权利要求70所述的组合物，还包含与所述反义链的序列单元中的引物结合位点杂交的引物。3.根据权利要求70所述的组合物，还包含与所述反义链的序列单元中的引物结合位点杂交的延伸的引物。4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述延伸的引物包含含有标记的可逆终止的核苷酸。5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述可逆终止的核苷酸共价附接到所述延伸的引物。6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述可逆终止的核苷酸被解封闭。7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述标记被去除。8.根据权利要求3所述的组合物，其中所述延伸的引物包含封闭部分。9.根据权利要求3所述的组合物，其中所述延伸的引物包含加帽部分。10.根据权利要求3所述的组合物，其中所述引物结合位点连同与其杂交的引物、聚合酶和核苷酸形成三元复合物。11.根据权利要求3所述的组合物，其中所述延伸的引物比所述引物长至少100个核苷酸。12.根据权利要求70所述的组合物，还包含与所述有义链的序列单元中的引物结合位点杂交的第二引物。13.根据权利要求70所述的组合物，还包含与所述有义链的序列单元中的引物结合位点杂交的延伸的第二引物。14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述延伸的第二引物包含含有标记的可逆终止的核苷酸。15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述可逆终止的核苷酸共价附接到所述延伸的引物。16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述可逆终止的核苷酸被解封闭。17.根据权利要求14所述的组合物，其中所述标记被去除。18.根据权利要求13所述的组合物，其中所述延伸的引物包含封闭部分。19.根据权利要求13所述的组合物，其中所述延伸的引物包含加帽部分。20.根据权利要求13所述的组合物，其中所述引物结合位点连同与其杂交的第二引物、聚合酶和核苷酸形成三元复合物。21.根据权利要求13所述的组合物，其中所述延伸的引物比所述引物长至少100个核苷酸。22.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述有义链在固体支持物上，并且其中所述反义链使用结合到所述有义链的序列单元中的引物结合位点的扩增引物从所述2CN115516104A权利要求书2/9页有义链合成。23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述扩增引物共价附接到所述固体支持物。24.根据权利要求22所述的组合物，其中所述扩增引物不共价附接到所述固体支持物。25.根据权利要求70‑21中任一项所述的组合物，其中所述固体支持物包含捕获引物，其中所述有义链通过经由滚环扩增沿着核酸模板延伸与所述核酸模板杂交的捕获引物来合成，并且其中所述反义链通过延伸与所述有义链的序列单元中的引物结合位点结合的扩增引物来合成。26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述核酸模板是