一种土壤DNA快速提取方法及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112646806A(43)申请公布日2021.04.13(21)申请号202110199918.3(22)申请日2021.02.23(71)申请人苏州易迈吉生物医药科技有限公司地址215143江苏省苏州市相城区黄埭镇安民路6号(72)发明人贾萌萌潘韵芝朱国强(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书2页说明书4页附图2页(54)发明名称一种土壤DNA快速提取方法及试剂盒(57)摘要本发明涉及一种高效提取土壤微生物DNA的方法，本试剂盒无需有机溶剂，使用胍盐和无机盐缓冲液DNA提取试剂盒相结合的方法，能够有效去除腐殖质，脂类和糖类物质对DNA提取的干扰，能适应于各种土壤类型，能够有效地富集DNA，并去除腐殖质的污染。DNA纯度和浓度检测实验结果证明本发明提取方法获得的DNA既能够达到下游实验的要求，也能有效的降低腐殖质的影响。CN112646806ACN112646806A权利要求书1/2页1.一种土壤DNA高效提取试剂盒，其特征在于：由以下七种溶液组成：(1)Pre‑Wash溶液：为KCl和硫酸铵的混合溶液，其中，KCl的浓度为500mM‑2M之间，优选浓度为650mM‑1.25M之间；硫酸铵的浓度为200‑950mM之间，优选浓度为350‑450mM之间；(2)土壤裂解液：为柠檬酸钠、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、SDS和NaCl的混合溶液，混合溶液中柠檬酸钠的浓度为10‑100mM之间，优选浓度为50mM；CTAB的质量浓度为0.1‑1%之间，优选质量浓度为0.2‑0.5%之间；SDS的质量浓度为0.2‑2％之间，优选质量浓度为0.5‑1％之间；NaCl的浓度为20‑600mM之间，优选浓度为50‑200mM之间；(3)杂质沉淀剂：为曲拉通X‑100和EDTA的混合溶液，其中，曲拉通X‑100体积比浓度为0.5‑3%之间，优选体积比浓度为1‑2%之间；EDTA的浓度为10‑100mM之间，优选浓度为20‑50mM之间；(4)DNA结合液：为NaCl、乙酸钠和PEG8000的混合溶液，其中，NaCl的浓度为500mM‑2M之间，优选浓度为1‑2M之间；PEG8000质量浓度为10‑30%之间，优选浓度为15‑20%之间，乙酸钠的浓度为500mM‑2M之间，优选浓度为1‑1.5M之间，用醋酸调溶液的pH值为4‑5之间，优选PH为4.5；(5)蛋白杂质去除液：为硫酸铵和乙醇的混合溶液，其中，硫酸铵的浓度为300mM‑2M之间，优选浓度为205‑450mM之间；乙醇浓度为40‑60vt％之间，优选浓度为50vt％；(6)DNA漂洗液：为NaCl和乙醇的混合物，其中，乙醇的浓度为65‑85vt%之间，优选浓度为75‑80vt%之间；NaCl的浓度为20‑200mM之间，优选浓度为50‑100mM之间；(7)DNA洗脱液：5mM的Tris‑HCl缓冲液，pH值8.0‑8.5。2.一种通过权利要求1所述的土壤DNA提取试剂盒提取土壤DNA的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)称取新鲜土壤0.5‑1g于2mLEP管中，加入200μLPre‑Wash溶液，在漩涡振荡器上振荡2min；(2)加入600μL土壤裂解液，涡旋震荡5min至样本充分混匀；70℃孵育10min，孵育期间震荡2‑3次；(3)12,000rpm离心3min，取上清液至新的1.5ml离心管中；(4)将步骤(3)获得的上清液转移到新的EP管中，随后上清液加入100µL杂质沉淀剂，涡旋混匀后冰浴5min，12,000rpm离心3min；(5)将步骤(4)获得的上清液转移500µL到新的EP管中，加入250µLDNA结合液和500µL乙醇；(6)将步骤(5)获得的上清混合液转移到DNA吸附硅胶柱，以12000rpm的转速离心1min，移除离心液并保留DNA吸附柱；(7)DNA吸附柱重新放入收集管中，向DNA吸附柱中加入500μL蛋白杂质去除液，以12000rpm的转速离心2min，移除离心液并保留DNA吸附柱；(8)将DNA吸附柱重新放入收集管中，向DNA吸附柱中加入500μL蛋白杂质去除液，以12000rpm的转速离心2min，移除离心液并保留DNA吸附柱；(9)将DNA吸附柱放入收集管中，向DNA吸附柱中加入700μLDNA漂洗液，以12000rpm的转速离心2min；将收集管中的离心液移除并保留DNA吸附柱，15000rpm转速下空管离心5min；2CN112646806A权利要求书2/2页(10)将DNA吸附柱放入收集管中，向DNA吸附柱中加入100μLDNA洗脱液，静置2min，15000rpm转速下离心2min，离心液即为土壤DNA溶液。3CN11264680