土壤DNA提取试剂盒.doc

技术咨询电话：400-607-9999

注意：本制品仅供研究使用，请勿用于临床治疗等其他用途
土壤DNA提取试剂盒
SoilDNAout
货号:M090064

产品及特点
由于土壤中有机质含量丰富,尤其是其中的腐殖酸对PCR等后续反应有极大的抑制作用,所以从土壤微生物提取高纯度的DNA一直是十分棘手的问题。本产品是本公司精心优化的专门用于从各种土壤样品和河海沉积物中提取高质量的DNA的试剂。
去污染效果好，OD260/280一般都在1.8以上,OD260/340一般都在3.0以上(表示腐殖酸少),得到的DNA样品原液或稀释液可以直接用于PCR等后续反应。
产量高，每克土壤一般可以提取到5ug左右DNA，片段长度在30Kb左右。
操作过程简单快速，只需要30分钟。
扩容性好，既可以在1.5mL离心管中微量提取，也可以在50mL离心管中进行大规模制备。
试剂无毒无害,环保。

规格及成分
成份30次包装溶液A15mL溶液B15mL使用手册1份注：溶液A和溶液B均为无色液体，溶液A4℃保存时会产生沉淀，用前需要65℃溶化并混匀。

运输及保存
常温运输，4℃保存，保存期为一年。

使用方法
65℃预热溶液A，待其沉淀溶化后，充分混匀，取0.5mL加入到1.5mL塑料离心管中并放置于65℃待用。
称取0.1-0.3g的土壤，加入到含预热溶液A的离心管中，震荡器上剧烈震荡5-10分钟。如果是扩量操作，可以使用更多土壤和较大离心管。也可以将同一种土壤在较大离心管中震荡处理，然后再分到1.5mL离心管中。注意:不论使用大的还是小的离心管，一定要让管底的土壤震荡起来。
将离心管置于65℃水浴中保温至少5分钟。
13000-15000g室温离心3分钟，将上清转移到一新离心管中(上清液一般呈淡黄色或深棕色，具体取决于腐殖酸的含量，上清的体积一般为300-400µL)。
在上清液中加入等体积的溶液B，上下颠倒30秒充分混匀，溶液将呈白色或淡黄色混浊状。
将离心管冰浴至少5分钟。
13000-15000g室温离心3分钟，转移上清到新的1.5mL离心管中，上清液颜色将比第4步得到的上清的颜色稍淡，体积在0.7mL左右。
加入0.2mL的氯仿(自备)，震荡器上充分振荡30秒混匀。注意:一定要让管底的溶液震荡起来。
13000-15000g室温离心3分钟，小心转移上清到新离心管中。说明：离心后两相交界面将有白色膜状物，其中有机相部分颜色较深，一般呈淡棕色。上清的颜色取决于土壤中腐殖酸的含量。
重复第8步和第9步一次。最后将上清转移到新的1.5mL离心管时，不要超过0.5mL，否则没有空间加两倍体积的乙醇。如果有多余的可以弃之不用。
加入2倍体积的乙醇(自备)，上下颠倒30秒混匀，15000g离心5分钟,弃上清，管底将有微小DNA沉淀，有时候呈棕色。注意：不要用异丙醇代替乙醇，否则腐殖酸更容易于DNA共沉淀。
加入1mL75%乙醇，震荡，13000-15000g室温离心3分钟，弃上清。
重复上步清洗一次。注意：75%乙醇洗两次有助于去除部分腐殖酸。
短暂离心，吸弃残留的75%乙醇（约50uL），室温晾干。注意：一定要去除残留的75%乙醇，否则会影响后续反应和电泳上样（样品会飘走）。
加入30uLTE缓冲液溶解沉淀。注意：不知道样品土壤DNA产率前最好不要加过多TE，如果DNA浓度高，可以再加TE稀释。
DNA即可用于电泳、酶切和PCR等反应。电泳时最好采取电泳后染色，因为实验发现，残留腐殖酸会吸附走大量的EB，使在腐殖酸后面的DNA不能染色。PCR时，最好按终体积的1/10加入随赠的PCR抑制物清除剂（CAT#：M020007）。

疑难解答
Q:如何判断提取的ＤＮＡ没有腐植酸污染？
A：方法一是目测法，即看得到的溶液是否无色。如果呈淡棕黑色或淡黄色，说明可能是少量残留的未除尽的腐植酸。方法二是检测最大光吸收。注意：有腐植酸污染并不表示DNA不能使用，有的腐殖酸并不抑制PCR扩增。
Q:腐殖酸的最大吸收波长是多少？
A：腐植酸（humicacid）是一大类呈棕黑色或黑色的物质,其结构千差万别，土壤中腐殖酸的组成和特点随土壤不同而不同，所以其最大吸收波长也各不相同，有的土壤的腐殖酸在260nm有最大吸收（见Appl.Environ.Microbiol.,63：4993,1997），有的则在340nm。所以用特定的波长测定OD值时波长的选定要根据土壤而决定。Sigma,Fluke等公司出售的腐植酸产品成分一般比较简单，其最大吸收波长不能推广到成分更为复杂的土壤腐殖酸样品。
Q:本产品是否彻底去除土壤DNA中的所有腐植酸?
A:腐植酸（humicacid）是动、植物的残骸经过微生物的分解、转化和成千上万年的复杂化学反应而产生的特性各异的一大类物质，其含量和种