一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒及提取方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106350509A(43)申请公布日2017.01.25(21)申请号201610904346.3(22)申请日2016.10.18(71)申请人哈尔滨博泰生物科技有限公司地址150030黑龙江省哈尔滨市香坊区木材街59号东北农业大学同位素楼211房间(72)发明人裴熙祥孙孝政(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书2页说明书3页附图1页(54)发明名称一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒及提取方法(57)摘要本发明公开了一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒及提取方法。快速高效的唾液DNA提取试剂盒包括了细胞裂解液，DNA结合液，漂洗液和洗脱液。唾液DNA提取方法至少包括以下三个步骤：(1)细胞裂解：唾液中加入细胞裂解液，得到含有游离DNA的细胞裂解液；(2)将DNA结合液加入上一步得到的细胞裂解液，得到DNA-磁珠吸附复合体；(3)利用漂洗液和洗脱液对上一步生成的复合体进行洗脱，去除RNA和其他杂质，得到高纯度DNA。本发明采用一种新型的细胞裂解液，成本低，提取的DNA纯度高，完整性好，无RNA残留，可用于高通量测序，基因分型及一般分子生物学实验操作。CN106350509ACN106350509A权利要求书1/2页1.一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒，其特征在于包括口腔细胞清洗液、细胞裂解液、DNA结合液、磁珠、洗涤液和洗脱液。2.一种快速高效的唾液DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将1mL唾液置于1.5mL离心管中，12000rpm离心2min，小心的吸弃上清，收集口腔细胞沉淀；(2)向收集得到的口腔细胞沉淀中加入1mL口腔细胞清洗液，反复吹打20次混匀样品，12000rpm离心2min，小心的吸弃上清，得到清洗过的口腔细胞沉淀；(3)向沉淀中依次加入300μL口腔细胞裂解液和20μLRNase，涡旋震荡5s使样品与裂解液充分混匀，37℃孵育10min；(4)配置加有磁珠的DNA结合液：磁珠充分混匀后，取20μL加入300μL的DNA结合液（可提前按本比例同时配置本次实验所需混合液）；(5)向步骤(3)中得到的混合物中继续加入320μL加有磁珠的DNA结合液，涡旋振荡5s后，室温放置5min；(6)将上一步获得的混合物置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁时，吸弃溶液，避免接触磁珠，保留结合有DNA的磁珠；(7)向离心管中加入500μL洗涤液1，将离心管从磁力架上取下涡旋振荡5s，再置于磁力架上静置2min后，吸弃洗涤液，同时避免接触磁珠；(8)向离心管中加入500μL洗涤液2，将离心管从磁力架上取下涡旋振荡5s，再置于磁力架上静置2min后，吸弃洗涤液，同时避免接触磁珠；(9)重复步骤(8)一次；(10)将步骤(9)得到的结合有DNA的磁珠在室温下静置10min，晾干，加入50μL洗脱液或去离子水，涡旋振荡混匀使磁珠完全重悬于洗脱液中，静置2min；(11)再次将离心管置于磁力架上静置2min，转移洗脱液至新的离心管中-20℃保存备用。3.根据权利要求1所述的一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的唾液样本为人体唾液样本。4.根据权利要求2所述的一种快速高效的唾液DNA提取方法，其特征在于，所述的唾液样本为人体唾液样本。5.根据权利要求1所述的一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的口腔细胞清洗液为pH6.8的0.05MPBS缓冲液（由0.05mol/LNa2HPO4溶液和0.05mol/LKH2P04溶液等体积混合）。6.根据权利要求1所述的一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的细胞裂解液为：pH8.0的40-150mM的Tris-HCl缓冲盐，优选浓度为100mM；4mM/mL的异硫氰酸胍；溶度为10-20%的非离子表面活性剂，优选为16%；含量为0.5U-23U的复合酶类，优选浓度为2U；浓度为80-150mM的可溶性盐，优选为100mM；浓度为40-60mM的金属离子螯合剂，优选为50mM。7.根据权利要求6所述的的非离子表面活性剂，其特征在于，该非离子表面活性剂成分可为烷基苯磺酸钠、烷基磺酸钠、脂肪醇硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚等，优选十二烷基磺酸钠。2CN106350509A权利要求书2/2页8.根据权利要求6所述的可溶性盐，其特征在于，该可溶性盐成分可为可溶性钠盐硫酸钠，氯化钠等，优选为硫酸钠。9.根据权利要求6所述的复合酶类，其特征在于，该复合酶类成分包括脂酶，蛋白酶，淀粉酶，甘露聚糖酶，纤维素酶，其摩尔比例优选为1:2:1:1:1。10.根据权利要求6所述的金属离子螯合剂，其特征在于该金属离子螯合剂成分可为乙二胺四乙酸二钠，乙二胺