mobio试剂盒提取土壤DNA的步骤(翻译).doc

UltraCleanSoilDNAIsolationKitSample详细过程
全过程戴上手套
在2mlBeadSolutionTubes里加入0.25—1g土样（注意：请参照提示和纠错指南确定加入土壤的量）。
发生的反应：土样或废渣样本被装入到BeadTube中。这是溶解过程的第一步。BeadSolution是一种打散土壤颗粒的溶液并开始溶解腐殖酸。
轻微地漩涡混合。
发生的反应：混合样本和BeadSolution。
检查S1溶液，如果S1溶液有沉淀，使用前加热到60℃使沉淀溶解。
发生的反应：S1溶液中含有SDS。如果冷却了就会产生沉淀。加热到60℃会使SDS溶解。S1溶液在温热的时候可以使用。
加入60μlS1溶液，漩涡几次或简短地漩涡（3-4s）。
发生的反应：S1溶液含有SDS。这是一种帮助细胞溶解的洗涤剂。这种洗涤剂可以破坏脂肪酸和几种微生物细胞膜相关的脂类。
加入200μlIRS溶液（抑制剂去除的溶液）。只有当DNA要用于PCR时才进行此步。
发生的反应：IRS是一种专门设计的用于沉淀腐殖酸和其他PCR抑制物的试剂。DNA要用于PCR时需要进行此步沉淀。腐殖酸通常呈棕色。他们属于有机化合物的一个大组分，存在于大多数富含有机质的土壤中。
确保使用MOBIOVortexAdaptertubeholder进行漩涡时beadtube是水平放置的。最大速度漩涡10min。（更少量的DNA剪切见可选择的溶解方法）
注意：如果使用可放置多于12支试管的24空位的VortexAdapter，增加5—10min的漩涡时间。
发生的反应：略，见使用说明。
将试管在10000×g离心30s。注意：不能超过10000×g否则试管会坏。
发生的反应：此时细胞的残骸、土壤、珠子和腐殖酸等的微粒将结合成沉淀。DNA在液体状的上清液中。
将上清液转移到另一支干净的2mlCollectionTube中。
注意：根据不同土壤类型0.25g土壤将会有400—450μl上清液。上清液中可能仍然包含一些土壤颗粒。
在CollectionTube中加入250μlS2溶液漩涡5s。4℃静置5min。
发生的反应：S2溶液中含有一种蛋白质沉淀试剂。这一步对于移除可能降低DNA纯度和抑制后续DNA利用的污染蛋白十分重要。
10000×g离心1min。
为了避免聚集成团，将整个上清液转移到另一只干净的2mlCollectionTube中。
发生的反应：此时的沉淀物包含了腐殖酸、细胞残骸和蛋白质的残渣。为了获得最大量和质量最高的DNA，尽量避免将任何的团状物（颗粒）转移到试管中。
使用前摇晃S3溶液，加1.3mlS3溶液到上清液中漩涡5s。
注意：大量的溶液将会漫到试管边缘，手拿试管时要小心。
发生的反应：S3溶液是一种使NA凝结的盐溶液。DNA在高盐浓度中凝结在硅砂上
将700μl上步的溶液转入SpinFilter10000×g离心1min。
弃掉流出液将剩下的上清液加入SpinFilter，10000×g离心1min。重复此步知道所有的上清液都通过SpinFilter。
注意：每个样本需要三次添加过程。
发生的反应：DNA选择性地结合在spinfilter的硅膜上。几乎所有污染物都通过了过滤膜，只留下需要的DNA。
加入300μlS4溶液10000×g离心30s。
发生的反应：S4是一种用于进一步清洁附着在spinfilter硅膜上DNA的清洗溶液。这种洗涤剂移除了使DNA粘附在硅膜上的盐、腐殖酸和其他污染物的残渣。
注意：如果需要可以进行一次以上的进一步DNA清洗。在土壤中含有很高的腐殖酸成分时，重复清洗的步骤很有益。
弃掉2mlCollectionTube中的上层洗涤流出液。
发生的反应：洗涤流出液只是包含了乙醇洗涤溶液和没有粘附到spinfilter膜上的成分的废物。
10000×g离心1min。
发生的反应：此步移除掉S4溶液。移除所有的洗涤溶液是十分必要的，因为洗涤液将会影响DNA的下游反应。
小心地将SpinFilter放入新的干净的2mlCollectionTube中。避免S4溶液溅到SpinFilter中。
加入500μlS5溶液到白色滤膜的中央。
10000×g离心30s。
发生的反应：当S5溶液（洗脱缓冲液）通过硅膜时，DNA脱离下来流经滤膜进入collectiontube中。
弃掉SpinFilter。试管中的DNA可用于PCR了。
建议DNA冷冻在-80℃—-20℃中。