一种基于化学发光的新型冠状病毒中和抗体检测试剂及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113588945A(43)申请公布日2021.11.02(21)申请号202110810071.8(22)申请日2021.07.18(66)本国优先权数据202110736914.42021.06.30CN(71)申请人杭州迈尔德生物科技有限公司地址311800浙江省杭州市滨江区长河街道滨安路688号2幢C楼2层218室(72)发明人范春雷(74)专利代理机构杭州中成专利事务所有限公司33212代理人朱莹莹(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)G01N33/543(2006.01)权利要求书2页说明书7页G01N21/82(2006.01)序列表7页附图4页(54)发明名称一种基于化学发光的新型冠状病毒中和抗体检测试剂及试剂盒(57)摘要本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于化学发光的新型冠状病毒中和抗体检测试剂及试剂盒。一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂，为带磁珠标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒。本发明公开了一种试剂盒，包括磁珠标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒、吖啶酯标记的重组人ACE2蛋白、超顺磁珠、化学发光启动液等相关材料。本发明通过磁微粒化学发光法定量分析新型冠状病毒感染后或接种疫苗后体内是否产生抗新冠病毒S蛋白的中和抗体，并计算出中和抗体的抑制率，从而对感染新型冠状病毒后或接种疫苗后体内是否产生保护抗体做出定量分析，为新型冠状病毒后期的血清学流行病普查及疫苗接种指导提供第一手资料。CN113588945ACN113588945A权利要求书1/2页1.一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂，为带磁珠标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒Mag‑nCoVSpsvirus。2.权利要求1所述新型冠状病毒中和抗体检测试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将新型冠状病毒棘突蛋白的C末端依次接上人工设计的含跨膜序列的序列、蛋白定点生物素化序列，将其标记为nCoVS‑TM‑AVI；该人工设计序列经宿主细胞密码子优化后基因合成并亚克隆到慢病毒表达载体pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copGFP的CMV启动子下，构建表达新型冠状病毒棘突蛋白S‑定点生物素化序列融合蛋白的质粒，将其标记为pMLD‑nCoVS；2)将步骤1)构建好的质粒pMLD‑nCoVS与pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备nCoVS.copGFP慢病毒，并转染新的293V细胞，荧光显微镜下挑取高表达克隆，建立nCoVS.copGFP/293V稳转细胞系；3)将步骤1)构建好的质粒pMLD‑nCoVS与pH1质粒、pH2质粒共转染到步骤2)建立的nCoVS.copGFP/293V稳转细胞系，转染后48小时和72小时各收集培养上清液一次；合并两次收集的上清液，4℃,4000g离心10分钟，弃沉淀；取上清，4℃,20000g离心20分钟，弃沉淀；取上清，过0.45μm孔径滤膜后，4℃,85000g离心90分钟，弃上清；沉淀即为新型冠状病毒棘突蛋白假病毒，用pH7.4的PBS溶液重悬，制备含新型冠状病毒棘突蛋白S浓度≧1mg/ml的假病毒悬液；4)用偶联抗新型冠状病毒棘突蛋白S蛋白抗体的磁珠纯化从步骤3)制备的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒重悬液，并制备成含新型冠状病毒棘突蛋白S浓度≧1mg/ml的假病毒PBS悬液；5)将步骤4)制备的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒用生物素蛋白连接酶使其S蛋白C‑末端定点生物素化，获得生物素化的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒，将其标记为nCoVSpsvirus‑Biotin；6)将链霉亲和素SA偶联于羧基磁珠，获得Mag‑SA；将步骤5)获得的nCoVSpsvirus‑Biotin与Mag‑SA共孵育，获得牢固标记磁珠的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒，将其标记为Mag‑nCoVSpsvirus。3.根据权利要求2所述新型冠状病毒中和抗体检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述新型冠状病毒棘突蛋白基因为GenBank:NC_045512.2中编码Spikeglycoprotein(GeneID:43740568)的基因序列；所述人工设计的含跨膜序列的序列为TLTERLREKISRAFYNHGLLCASYPIPIILFTGFCILACCYPLLKLPL(ACCCTGACAGAGCGGCTGAGAGAGAAGATCAGCCGGGCCTTCTACAACCACGGCCTGCTGTGCGCCTCCTATCCCATCCCTATCATCCTGTTCACAGGCTTTTGTATCCTGGCCTGCTGTTACCCTCTGCTGAAGCTGCCACTG)；所述蛋白定点生物素化序列为生物素蛋白连接酶BirA，其识别位点序列为GLNDIFEAQKIEW