一种基于荧光蛋白的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113832188A(43)申请公布日2021.12.24(21)申请号202110810072.2G01N33/558(2006.01)(22)申请日2021.07.18G01N33/548(2006.01)C12R1/93(2006.01)(71)申请人杭州迈尔德生物科技有限公司地址311800浙江省杭州市滨江区长河街道滨安路688号2幢C楼2层218室(72)发明人范春雷(74)专利代理机构杭州中成专利事务所有限公司33212代理人朱莹莹(51)Int.Cl.C12N15/867(2006.01)C12N15/62(2006.01)C12N7/04(2006.01)G01N33/569(2006.01)G01N33/68(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表9页附图4页(54)发明名称一种基于荧光蛋白的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒及应用(57)摘要本发明属于生物技术领域，一种基于荧光蛋白的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒及应用。试剂盒包括带荧光蛋白标签的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒、重组人ACE2蛋白、抗人IgG抗体、兔抗新型冠状病毒棘突蛋白多抗、层析试纸条等相关材料。本发明通过配体‑受体法竞争法定量分析新型冠状病毒感染后或接种疫苗后体内是否产生抗新冠病毒S1蛋白的中和抗体，并计算出中和抗体的抑制率。中和抗体的抑制率，即抗新型冠状病毒S蛋白总IgG抗体的获得率可作为新冠肺炎患者康复后和疫苗接种者血清保护抗体的评估。抗新型冠状病毒S蛋白总IgG抗体的获得率越高表明免疫产生的抗体越多；中和抗体的抑制率越高表明中和阻断抗体越多，保护作用越强。CN113832188ACN113832188A权利要求书1/2页1.一种含有带荧光蛋白标签的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒,制备方法包括以下步骤：1)将新型冠状病毒棘突蛋白的C末端接上荧光蛋白，将其标记为nCoVS‑荧光蛋白；该人工设计序列经宿主细胞密码子优化后基因合成并亚克隆到慢病毒表达载的CMV启动子下，构建表达新型冠状病毒棘突蛋白S‑荧光蛋白融合蛋白的质粒，将其标记为pMLD‑nCoVS‑荧光蛋白；2)将步骤1)构建好的质粒pMLD‑nCoVS‑荧光蛋白与pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备nCoVS‑荧光蛋白慢病毒，并转染新的293V细胞，荧光显微镜下挑取高表达克隆，建立nCoVS‑荧光蛋白/293V稳转细胞系；3)将步骤1)构建好的质粒pMLD‑nCoVS‑荧光蛋白与pH1质粒、pH2质粒共转染到A步骤2)建立的nCoVS‑荧光蛋白/293V稳转细胞系，转染后48小时和72小时各收集培养上清液一次；合并两次收集的上清液，4℃,4000g离心10分钟，弃沉淀；取上清，4℃,20000g离心20分钟，弃沉淀；取上清，过0.45μm孔径滤膜后，4℃,85000g离心90分钟，弃上清；沉淀即为新型冠状病毒棘突蛋白假病毒，将其标记为nCoVSpsvirus‑荧光蛋白；用pH7.4的PBS溶液重悬，制备含新型冠状病毒棘突蛋白S浓度≧1mg/ml的假病毒悬液；4)用偶联抗新型冠状病毒棘突蛋白S蛋白抗体的磁珠纯化从步骤3)制备的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒重悬液，并制备成含新型冠状病毒棘突蛋白S浓度≧1mg/ml的假病毒PBS悬液。2.如权利要求1所述的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒，其特征在于：步骤1)中，所述新型冠状病毒棘突蛋白基因为GenBank:NC_045512.2中编码Spikeglycoprotein(GeneID:43740568)的基因序列；所述荧光蛋白为tdTomato；所述密码子优化的宿主为人；其中，表达新型冠状病毒棘突蛋白和tdTomato荧光蛋白标签的人工设计序列经人宿主细胞密码子优化后的核酸序列如SEQIDNO：1所示，构建好的质粒所表达的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.权利要求1所述新型冠状病毒棘突蛋白假病毒用于制备检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒。4.基于荧光蛋白的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒，其特征在于：含有带荧光蛋白标签的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒。5.如权利要求4所述的一种基于荧光蛋白的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括免疫层析试纸条，免疫层析试纸条包括底衬、硝酸纤维素膜、样品垫、释放垫和吸水纸。6.权利要求4所述的一种基于荧光蛋白的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒的制备方法，样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上，释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区，样品垫叠压在释放垫上；检测区的硝酸纤维素膜上设置靠近释放垫的二条检测线区(T1、T2线)和