用于测序的DNA和RNA的单管制备.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114269917A(43)申请公布日2022.04.01(21)申请号202080058336.7(74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公(22)申请日2020.08.17司72001代理人权陆军李唐(30)优先权数据62/8889632019.08.19US(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12Q1/6806(2018.01)2022.02.17(86)PCT国际申请的申请数据PCT/EP2020/0729582020.08.17(87)PCT国际申请的公布数据WO2021/032660EN2021.02.25(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人D·M·克拉斯A·洛夫乔伊M·洛伊泽K·M·麦克林托克权利要求书2页说明书10页附图4页(54)发明名称用于测序的DNA和RNA的单管制备(57)摘要本发明是用于同时地从存在于样品中的DNA和RNA形成用于核酸测序的文库的方法和组合物。CN114269917ACN114269917A权利要求书1/2页1.一种制备用于测序的RNA和DNA靶标混合物的方法，所述方法包括：a)提供包含RNA和DNA靶标的样品；b)在不允许DNA变性的条件下使所述样品与靶标特异性引物接触；c)用具有反转录酶活性的核酸聚合酶延伸与至少一个RNA靶标杂交的所述靶标特异性引物以形成cDNA链；d)使所述样品与RNaseH活性及核酸末端修复活性接触以形成双链DNA和双链cDNA混合物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标特异性引物包含条形码。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述条形码将所述双链DNA和双链cDNA混合物中的cDNA分子与DNA分子区分开。4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述核酸末端修复活性由DNA聚合酶、核酸外切酶和多核苷酸激酶的混合物组成。5.根据权利要求1至4所述的方法，所述方法进一步包括对所述RNA和DNA靶标进行片段化的预备步骤。6.根据权利要求1至5所述的方法，所述方法进一步包括使所述双链DNA和双链cDNA混合物与衔接子接触以形成衔接的DNA。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述衔接子包含一个或多个条形码。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述条形码选自唯一分子标识符(UID)和样品标识符(SID)。9.根据权利要求6所述的方法，所述方法进一步包括对所述衔接的DNA进行扩增及任选地进行测序的步骤。10.一种核酸文库，所述核酸文库由包含以下各项的方法形成：提供包含RNA和DNA靶标的样品；a)在不允许DNA变性的条件下使所述样品与靶标特异性引物接触；c)用具有反转录酶活性的核酸聚合酶延伸与至少一个RNA靶标杂交的所述靶标特异性引物以形成cDNA链；以及d)使所述样品与RNaseH活性及核酸末端修复活性接触以形成双链DNA和双链cDNA混合物。11.根据权利要求10所述的文库，其中双链DNA和双链cDNA混合物中的DNA进一步包含衔接子。12.根据权利要求10至11所述的文库，其中所述靶标特异性引物包含条形码，并且所述双链cDNA可通过所述条形码的存在与所述双链DNA区分。13.一种用于通过根据权利要求1所述的方法制备用于测序的RNA和DNA靶标混合物的试剂盒，所述试剂盒包括：a)一个或多个靶标特异性引物，其具有条形码；b)核酸聚合酶，其具有反转录酶活性；c)RNaseH；d)DNA聚合酶，其具有3′‑5‑核酸外切酶活性；e)多核苷酸激酶。2CN114269917A权利要求书2/2页14.根据权利要求13所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括衔接子和DNA连接酶。15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述衔接子包括一个或多个分子条形码和通用引物结合位点。3CN114269917A说明书1/10页用于测序的DNA和RNA的单管制备技术领域[0001]本发明涉及核酸测序领域。更具体地，本发明涉及富集用于测序的罕见核酸靶标的领域。背景技术[0002]对于DNA样品和RNA样品的单独制备和测序，存在许多工作流程。当需要从DNA和RNA两者获取信息时，一些工作流程是完全独立的，而其他工作流程可能会在过程中的某个步骤作为一个工作流程加入。在任一种情况下，如果需要从来自单一来源(例如患者样品)的DNA和RNA两者获取信息，则需要两个单独的样本，一个用于分离DNA，另一个用于分离RNA。这导致样品材料以及劳动力和试剂成本的浪费。对于珍贵的样品，诸如临床活检样品、法医样品或历史样品，可能没有足够的材料来对DNA和RNA执行两次单独的分离。出于对RNA相关步骤可能会损害DNA(例如通过变性)，而DNA相关步骤可能会损害RNA的