用于单分子测序样品制备的环化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111164219A(43)申请公布日2020.05.15(21)申请号201880064748.4(74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公(22)申请日2018.10.04司72001代理人任晓华黄希贵(30)优先权数据62/5694752017.10.06US(51)Int.Cl.C12Q1/6806(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12Q1/6855(2006.01)2020.04.03C12Q1/6869(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据PCT/EP2018/0769772018.10.04(87)PCT国际申请的公布数据WO2019/068797EN2019.04.11(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人J.A.约翰逊U.施莱希特D.阮M.乔治权利要求书1页说明书9页附图5页(54)发明名称用于单分子测序样品制备的环化方法(57)摘要本发明是经由夹板连接而制备和使用文库诸如单链环状核酸模板的测序文库的新型方法。CN111164219ACN111164219A权利要求书1/1页1.由靶标核酸形成环状分子的方法，其包括：a)将衔接子序列附接至所述靶标核酸的末端以形成衔接的靶标核酸；b)使所述衔接的靶标核酸与双链主链核酸接触；c)在所述主链和所述衔接的靶标核酸二者中产生单链突出端；d)使所述主链的单链突出端与所述衔接的靶标核酸的单链突出端杂交；e)将所述主链的末端与所述衔接的靶标核酸的末端连接以形成环状分子。2.权利要求1的方法，其中通过连接将所述衔接子附接至所述靶标核酸的末端。3.权利要求1的方法，其中通过延伸在5'-部分中包含衔接子序列的靶标特异性双组分引物，将所述衔接子附接至所述靶标核酸的末端。4.权利要求3的方法，其中在步骤b)之前扩增所述衔接的靶标核酸。5.权利要求1-4的方法，其中所述衔接子和所述主链包含互补的末端序列。6.权利要求1-5的方法，其中通过核酸酶消化产生单链突出端。7.权利要求1-6的方法，其中所述主链和衔接子序列包含外切核酸酶核酸酶抗性修饰，尤其是硫代磷酸酯键。8.权利要求1-7的方法，其进一步包括在步骤d)和e)之间的步骤中的聚合酶填充。9.对靶标核酸进行测序的方法，其包括以下步骤：a)将衔接子序列附接至所述靶标核酸的末端以形成衔接的靶标核酸；b)使所述衔接的靶标核酸与双链主链核酸接触；c)在所述主链和所述衔接的靶标核酸二者中产生单链突出端；d)使所述主链的单链突出端与所述衔接的靶标核酸的单链突出端杂交；e)将所述主链的末端与所述衔接的靶标核酸的末端连接以形成环状分子；f)分离所述环状分子的链以产生单链环状分子；和g)使测序引物与所述单链环状分子中的每一者退火；h)延伸退火的测序引物，由此对所述靶标核酸进行测序。10.权利要求9的方法，其中所述衔接子包含测序引物结合位点。11.权利要求9-10的方法，其中所述衔接子或所述主链包含至少一个条形码。12.权利要求9-11的方法，其中步骤f)中的链通过热或通过化学手段分离。13.权利要求9-11的方法，其中步骤f)中的链通过将一条链切口并通过外切核酸酶消化除去带切口的链来分离。14.权利要求9-13的方法，其中所述主链包含用于捕获部分的配体，且步骤f)中的链被捕获在固体支持物上。15.权利要求9-14的方法，其中步骤h)中的测序利用纳米孔装置。2CN111164219A说明书1/9页用于单分子测序样品制备的环化方法发明领域[0001]本发明涉及核酸分析领域，且更具体地，涉及制备用于核酸测序的环状模板。[0002]发明背景环状核酸模板在核酸分析中具有多种应用。将线性核酸转化成环状形式用于扩增(例如，通过滚环扩增(RCA))和随后的检测和定量，参见美国专利号RE44265。环状模板在测序中的应用也是本领域已知的。参见美国专利号7,302,146和8,153,375。这些策略产生包含靶标核酸的两条链的环状模板。本发明是产生适合用于测序的模板的文库的新型的有效方法，所述模板包含来自靶标核酸的每条链的环状单链分子。所述方法允许制备基本上不受限长度的模板。[0003]发明概述本发明是形成用于核酸测序的环状核酸分子或环状分子的文库的方法。[0004]在一些实施方案中，本发明是由靶标核酸形成环状分子的方法，其包括：将衔接子序列附接至所述靶标核酸的末端以形成衔接的靶标核酸；使所述衔接的靶标核酸与双链主链核酸接触；在所述主链和所述衔接的靶标核酸二者中产生单链突出端；使所述主链的单链突出端与所述衔接的靶标核酸的单链突出端杂交；将所述主链的末端与所述衔接的靶标核酸的末端连接以形成环状分子。在一些实施方案中，通过连接将所述衔接子附