生成用于单分子测序的单链环状DNA文库的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109312391A(43)申请公布日2019.02.05(21)申请号201780040192.0(74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公(22)申请日2017.07.14司72001代理人权陆军黄希贵(30)优先权数据62/3636452016.07.18US(51)Int.Cl.C12Q1/6806(2018.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12Q1/6869(2018.01)2018.12.27(86)PCT国际申请的申请数据PCT/EP2017/0679402017.07.14(87)PCT国际申请的公布数据WO2018/015318EN2018.01.25(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人J.莫U.施莱赫特权利要求书2页说明书9页附图5页(54)发明名称生成用于单分子测序的单链环状DNA文库的方法(57)摘要本发明包括用于核酸测序的环状单链模板、其制备和使用方法。CN109312391ACN109312391A权利要求书1/2页1.制备用于测序的靶核酸的方法，其包括：(a)提供包含所述靶核酸的样品；(b)使所述样品与包含两条链的衔接子分子接触，形成至少一个双链体区域和至少一个非双链体区域，所述非双链体区域包含至少一个通用引物结合位点；(c)将所述衔接子分子连接至所述靶核酸，以形成包含具有至少一个通用引物结合位点的非双链体区域的双链环状接合分子。2.权利要求1的方法，其进一步包括：(d)使所述接合分子与DNA聚合酶和与所述引物结合位点互补的通用引物接触，所述DNA聚合酶优选为链置换聚合酶；(e)延伸所述通用引物，由此经由边合成边测序测定所述靶核酸的序列。3.权利要求1的方法，其中所述衔接子包含两个双链体区域，其侧接具有两条未杂交链的单一非双链体区域。4.权利要求1的方法，其中所述衔接子包含侧接至少一个茎-环结构的两个双链体区域，每个结构包含双链体茎区域和非双链体环区域。5.权利要求1的方法，其中所述衔接子的每条链包含一个引物结合位点。6.权利要求1的方法，其在步骤b)前包括以下步骤：以模板非依赖性的方式将核苷酸添加至所述靶核酸的3'-端并将互补核苷酸添加至所述衔接子分子的3'-端，由此产生粘性末端。7.权利要求1的方法，其在步骤b)前包括以下步骤：用限制性内切核酸酶消化所述靶核酸和所述衔接子分子以生成相容的粘性末端。8.权利要求1的方法，其在步骤b)前包括以下步骤：用外切核酸酶消化所述靶核酸和所述衔接子分子的3'-端。9.权利要求1的方法，其中所述靶核酸和所述衔接子分子含有尿嘧啶碱基，并且所述方法在步骤b)前包括以下步骤：使所述靶核酸和所述衔接子分子与尿嘧啶-DNA-糖基化酶和内切核酸酶VIII接触。10.权利要求1-9的方法，其中所述衔接子包含一个或多个条形码，优选独特标识符(UID)、多重标识符(MID)或其组合。11.制备用于测序的靶核酸的方法，其包括：(a)提供包含所述靶核酸的样品；(b)使所述样品与包含形成双链体的两条链的衔接子分子接触，其中每条链包含通用引物结合位点；(c)将所述衔接子分子连接至所述靶核酸，以形成包含两个通用引物结合位点的双链环状接合分子。12.权利要求11的方法，其进一步包括：(d)使所述接合分子与DNA聚合酶和与所述引物结合位点互补的通用引物接触；(e)延伸所述通用引物，由此经由边合成边测序测定所述靶核酸的序列。13.用于测序靶核酸的组合物，其包含双链环状分子，所述双链环状分子由连接至包含两条链的衔接子的靶核酸组成，其中所述链形成至少一个双链体区域和至少一个非双链体区域，所述非双链体区域中的每条链含有通用引物结合位点。2CN109312391A权利要求书2/2页14.权利要求27的组合物，其进一步包含通用引物。15.权利要求27的组合物，其进一步包含具有链置换活性的核酸聚合酶。3CN109312391A说明书1/9页生成用于单分子测序的单链环状DNA文库的方法发明领域[0001]本发明涉及核酸测序的领域，且更具体地，涉及制备用于核酸测序的环状模板。[0002]发明背景环状模板用于测序的用途是本领域已知的。例如，PACIFICBIOSCIENCES使用SMRTBELL衔接子来产生此类模板。参见美国专利号7,302,146和8,153,375。环状单链模板在边合成边测序中具有若干优点：如果测序聚合酶可以进行滚环复制，则将多次读取模板并且将读取两条Watson和Crick链。配对链的多重读取允许更准确的共有序列输出。然而，现有的环状模板被设计成使得两个测序聚合酶可以结合各模板。两个聚合酶有可能相互干扰并引起合成的停滞或终止，产生次优的测序数据。本发明改进现有技术以实现更