用于提高核酸扩增反应效率的方法和组合物.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CNCN102272319102272319B(45)授权公告日2014.08.27(21)申请号201080004057.9(56)对比文件US6025545A,2000.02.15,说明书第89栏(22)申请日2010.01.07第5-15行.(30)优先权数据WO2004/011605A2,2004.02.05,全文.61/143,3502009.01.08USEP0821058A2,1998.01.28,全文.(85)PCT国际申请进入国家阶段日US2004/0219558A1,2004.11.04,说明书第2011.07.06[0009]-[0010]、[0035]、[0047]-[0048]、[0077]、(86)PCT国际申请的申请数据[0117]、[0127]、[0176]、[0178]段，图3.PCT/US2010/0203712010.01.07审查员朱宁(87)PCT国际申请的公布数据WO2010/080910EN2010.07.15(73)专利权人伯乐实验室公司地址美国加利福尼亚州(72)发明人龚晓松约翰·苏利文付荣典王岩埃文·H·伯西程曼(74)专利代理机构中科专利商标代理有限责任公司11021代理人王旭(51)Int.Cl.C12P19/34(2006.01)C12N9/10(2006.01)权权利要求书2页利要求书2页说明书38页说明书38页附图4页附图4页(54)发明名称用于提高核酸扩增反应效率的方法和组合物(57)摘要本发明提供用于提高核酸扩增反应效率的方法和组合物。本发明包括杂合聚合酶，其显示出与野生型聚合酶相比增加的持续合成能力以及降低的外切核酸酶活性。本发明还包括用于进行核酸合成和扩增反应的方法、组合物和试剂盒，其中减少引物的非特异性扩增。CN102272319BCN102739BCN102272319B权利要求书1/2页1.一种扩增样品中靶核酸的方法，所述方法包括：在反应混合物中温育所述靶核酸，所述反应混合物包含：至少一种引物,杂合聚合酶，其包含聚合酶结构域和异源DNA结合结构域,其中所述异源DNA结合结构域是Sso7dDNA结合结构域,和肌氨酸，所述肌氨酸处于这样的量，所述量足以将扩增反应的效率与缺少所述肌氨酸的反应混合物相比提高至少10%，其中所述肌氨酸的浓度为至少20mM并且不大于540mM，其中所述温育处于允许所述靶核酸通过所述杂合聚合酶扩增的条件下。2.权利要求1的方法，其中所述杂合聚合酶包括缺乏3’-5’外切核酸酶活性的家族B-样聚合酶。3.权利要求1的方法，其中所述杂合聚合酶为SEQIDNO:2。4.权利要求1的方法，其中所述杂合聚合酶在所述温育步骤过程中加热步骤前，与一种或多种抗体复合。5.权利要求4的方法，其中所述抗体包括重链可变区和轻链可变区,其中所述可变区包括互补决定区(CDRs),其中:(a)所述重链可变区CDRs分别为SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,和SEQIDNO:24,且所述轻链可变区CDRs分别为SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,和SEQIDNO:27;或(b)所述重链可变区CDRs分别为SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:30,且所述轻链可变区CDRs分别为SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,和SEQIDNO:33;或(c)所述重链可变区CDRs分别为SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,和SEQIDNO:36,且所述轻链可变区CDRs分别为SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,和SEQIDNO:39。6.权利要求1的方法，其中所述异源DNA结合结构域与SEQIDNO:3相同。7.权利要求1的方法，其中所述反应混合物还包含双链DNA结合染料。8.一种反应混合物，包含：杂合聚合酶,其中所述聚合酶包含聚合酶结构域和异源DNA结合结构域,其中所述异源DNA结合结构域是Sso7dDNA结合结构域;和肌氨酸,所述肌氨酸处于这样的量，所述量足以将扩增反应的效率与缺少所述肌氨酸的反应混合物相比提高至少10%，其中所述肌氨酸的浓度为至少20mM并且不大于540mM。9.权利要求8的反应混合物，还包含至少一种寡核苷酸引物。10.权利要求8的反应混合物，其中所述杂合聚合酶包括缺乏3’-5’外切核酸酶活性的家族B-样聚合酶。11.权利要求8的反应混合物，其中所述杂合聚合酶为SEQIDNO:2。12.权利要求8的反应混合物，其中所述杂合聚合酶与抗体复合。13.权利要求12的反应混合物，其中所述抗体包括重链可变区和轻链可变区,其中所述可变区包括互补决定区(CDRs),其中:(a)所述重链可变区CDRs分别为SEQIDNO:2