用于扩增mRNA的方法和组合物.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111712572A(43)申请公布日2020.09.25(21)申请号201880087136.7(74)专利代理机构上海专利商标事务所有限公司31(22)申请日2018.12.17100代理人陶家蓉(30)优先权数据62/599,4722017.12.15US(51)Int.Cl.C12N15/11(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12N15/10(2006.01)2020.07.20C12N5/0784(2010.01)(86)PCT国际申请的申请数据A61K39/00(2006.01)PCT/US2018/0660512018.12.17A61P35/00(2006.01)(87)PCT国际申请的公布数据WO2019/118978EN2019.06.20(71)申请人贝勒医学院地址美国得克萨斯州(72)发明人W·K·德克尔V·孔杜里权利要求书3页说明书24页序列表1页附图10页(54)发明名称用于扩增mRNA的方法和组合物(57)摘要本文提供了用于全长cDNA或cDNA片段的合成、扩增和体外转录的组合物和方法。提供了用于RNA的逆转录和体外转录的扩增的方法。还提供了用于向树突细胞加载所述RNA和同源裂解液用于免疫刺激的方法。CN111712572ACN111712572A权利要求书1/3页1.一种寡核苷酸，其包含SEQIDNO:1的序列。2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸还被定义为引物。3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含少于40个核苷酸。4.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸由SEQIDNO:1组成。5.一种组合物，其包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含SEQIDNO:1的核酸序列，并且其中所述第二引物包含SEQIDNO:2的核酸序列。6.如权利要求5所述的组合物，其中所述组合物还被定义为核酸扩增反应混合物。7.如权利要求5或6所述的组合物，其还包含第三引物，其中所述第三引物包含SEQIDNO:3的核酸序列。8.如权利要求7所述的组合物，其还包含核酸。9.如权利要求8所述的组合物，其中所述核酸是RNA。10.一种由模板mRNA合成第一cDNA链的方法，其包括以下步骤：a)使第一引物与所述模板mRNA杂交，其中所述第一引物包含SEQIDNO:2的核酸序列；b)用具有末端转移酶和模板转换活性的逆转录酶延伸所述第一引物，以生成具有oligo(C)突出端的部分第一cDNA链；c)使第二引物与所述部分第一cDNA链的所述oligo(C)突出端杂交，其中所述第二引物包含SEQIDNO:1的核酸序列；以及d)使用所述第二引物作为模板来从所述oligo(C)突出端延伸所述部分第一cDNA链，从而生成第一cDNA链。11.如权利要求10所述的方法，其还包括：e)分离所述模板mRNA和第一cDNA链；f)使第三引物与所述第一cDNA链杂交；以及g)延伸所述第三引物以生成第二cDNA链，从而生成双链cDNA。12.如权利要求11所述的方法，其中所述第二引物包含SEQIDNO:1的核酸序列。13.如权利要求11所述的方法，其中所述第三引物包含SEQIDNO:3的核酸序列。14.如权利要求11所述的方法，其中所述模板mRNA从样品获得。15.如权利要求14所述的方法，其中所述样品是肿瘤样品。16.如权利要求15所述的方法，其中所述肿瘤样品在从受试者取出之后储存在RNA稳定溶液中。17.如权利要求16所述的方法，其中所述RNA稳定溶液是18.如权利要求11所述的方法，其还包括由所述双链cDNA合成RNA。19.如权利要求18所述的方法，其中所述由所述双链cDNA合成RNA包括体外转录。20.如权利要求19所述的方法，其中体外转录包括添加第四引物、第五引物和RNA聚合酶，以及用所述RNA聚合酶由所述双链cDNA合成RNA。21.如权利要求20所述的方法，其中所述第四引物包含SEQIDNO:1的核酸序列。22.如权利要求21所述的方法，其中所述第四引物包含SEQIDNO:3的核酸序列。23.如权利要求20所述的方法，其中所述方法还包括对所述RNA加帽。24.如权利要求11所述的方法，其还包括扩增所述双链cDNA。25.如权利要求24所述的方法，其中所述第二引物包含SEQIDNO:1的核酸序列。2CN111712572A权利要求书2/3页26.如权利要求24所述的方法，其中所述第三引物包含SEQIDNO:3的核酸序列。27.如权利要求24所述的方法，其中扩增所述双链cDNA包括添加DNA依赖性DNA聚合酶、第四引物和第五引物，以及通过聚合酶链反应扩增所述cDNA。28.如权利要求27所述的方法，其中所述第