用于核酸的振荡扩增反应.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103608467103608467A(43)申请公布日2014.02.26(21)申请号201280030581.2C12N15/11(2006.01)(22)申请日2012.04.20C12Q1/48(2006.01)(30)优先权数据61/477,4372011.04.20US61/477,3572011.04.20US(85)PCT国际申请进入国家阶段日2013.12.20(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2012/0345892012.04.20(87)PCT国际申请的公布数据WO2012/145725EN2012.10.26(71)申请人梅撒技术国际公司地址美国加利福尼亚州(72)发明人蔡红内森·J·科布(74)专利代理机构中科专利商标代理有限责任公司11021代理人张国梁(51)Int.Cl.权利要求书3页权利要求书3页说明书25页说明书25页C12Q1/68(2006.01)序列表6页序列表6页附图27页附图27页(54)发明名称用于核酸的振荡扩增反应(57)摘要本发明的一个实施方案提供扩增包含在样品中的核酸靶序列的模板的方法。该方法包括将所述样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物含有与核酸靶序列的模板互补的引物。所述反应的温度在高温和低温之间振荡，其中在多个温度循环期间，温度的变化不大于约20℃。核酸靶序列的模板被扩增。CN103608467ACN1036847ACN103608467A权利要求书1/3页1.扩增包含在样品中的核酸靶序列的模板的方法，所述方法包括：将所述样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包含与所述核酸靶序列的模板互补的引物；使所述反应的温度在上限温度和下限温度之间振荡，其中在多个温度循环期间温度变化不大于约20℃；以及扩增所述核酸靶序列的模板。2.权利要求1的方法，其中在多个温度循环期间所述温度变化不大于约15℃。3.权利要求1的方法，其中在多个温度循环期间所述温度变化不大于约10℃。4.权利要求1的方法，其中在多个温度循环期间所述温度变化不大于约5℃。5.权利要求1的方法，其中一旦达到所述上限温度或所述下限温度，将所述温度保持在温度波动内一段时间。6.权利要求1的方法，其中一旦达到所述温度范围内的上限或下限温度，将所述温度变化为其它温度。7.权利要求1的方法，其中所述下限温度不小于约50℃。8.权利要求1的方法，其中所述上限温度不大于约85℃。9.权利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是单链DNA或RNA。10.权利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是双链DNA或RNA。11.权利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是RNA。12.权利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是DNA。13.权利要求1的方法，其中所述靶核酸的长度可小于1000bp。14.权利要求1的方法，其中所述靶核酸的长度可小于250bp。15.权利要求1的方法，其中所述靶核酸的长度可小于150bp。16.权利要求1的方法，其中所述靶核酸的长度可小于约100bp。17.权利要求1—16的方法，其中所述扩增反应混合物包含结合所述核酸的模板的相反链的引物对。18.权利要求17的方法，其中所述引物对具有长度和GC含量以致解链温度≥65℃。19.权利要求17的方法，其中所述引物对具有长度和GC含量以致解链温度≥70°。20.权利要求17的方法，其中所述引物对具有35—70个碱基对的长度。21.权利要求17的方法，其中所述引物对中每个引物的解链温度为70-80℃。22.权利要求17的方法，其中所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物各自具有40-47个碱基对的长度。23.扩增包含在样品中的核酸靶序列的模板的方法，所述方法包括：将所述样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包含引物或引物对，所述引物或引物对具有35-70个碱基对的长度并且与所述核酸靶序列的模板互补，并且其中所述引物对中每个引物的解链温度为70-80℃；DMSO；一价阳离子；二价阳离子；dNTPs；和2CN103608467A权利要求书2/3页DNA聚合酶；使所述反应的温度在上限温度和下限温度之间振荡，其中在多个温度循环期间温度变化不大于约20℃；以及扩增所述核酸靶序列的模板。24.权利要求23的方法，其中所述二价阳离子是选自由以下各项组成的组的盐：镁、锰、铜、锌或其任意组合。25.权利要求23的方法，其中所述一价阳离子是选自由以下各项组成的组的盐：钠、钾、锂、铷、铯、铵或其任意组合。26.权利要求1的方法，其中所述扩增反应混合物包含核酸去稳定剂。27.权利要求1的方法，其中所述扩增反应包含DNA聚合酶。28.权利要求