促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112094800A(43)申请公布日2020.12.18(21)申请号202010984944.2(22)申请日2020.09.18(71)申请人四川省恩乐生物工程有限公司地址610000四川省成都市高新区天府大道中段1388号1栋5楼594号(72)发明人宋筱荭邹弼丞钟立武汪敬雄王峰(74)专利代理机构成都帝鹏知识产权代理事务所(普通合伙)51265代理人黎照西(51)Int.Cl.C12N5/071(2010.01)C12N5/0775(2010.01)权利要求书1页说明书3页(54)发明名称促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法(57)摘要本发明提供了一种促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法，其方法包括步骤：(1)获取间充质干细胞，并传代培养；(2)将间充质干细胞接种在培养板上，于培养基A中培养1～2天；之后于培养基B中培养，每天更换一次培养基，共培养7～8天；然后，于培养基C中培养12～15天，获得胰岛细胞。本发明可以获得成熟的胰岛样细胞，并可以使得分化的细胞内外均具有含量高的胰岛素和C‑肽。CN112094800ACN112094800A权利要求书1/1页1.一种促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)获取间充质干细胞，并传代培养；(2)将间充质干细胞接种在培养板上，于培养基A中培养1～2天；之后于培养基B中培养，每天更换一次培养基，共培养7～8天；然后，于培养基C中培养12～15天，获得胰岛细胞；其中，所述培养基A为含有10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基；所述培养基B以DMEM/F12培养基为基础培养基，并添加20～25μmol白藜芦醇、2～3μmol全反式维甲酸、6～8μmol尼克酰胺、0.1～0.2μmol五肽胃泌素、1～10μmolL-谷氨酰胺、0.1～0.2μmol血小板源性生长因子、1～2μmolL-谷氨酰胺成纤维细胞生长因子、0.3～0.5μmol胰高血糖素样肽I；所述培养基C以DMEM/F12培养基为基础培养基，并添加20～25μmol白藜芦醇、2～3μmol全反式维甲酸、6～8μmol尼克酰胺、1～10μmolL-谷氨酰胺、0.1～0.2μmol血小板源性生长因子、1～2μmolL-谷氨酰胺成纤维细胞生长因子、0.05～0.1μmol胰岛素样生长因子、0.01～0.02μmol激活素A。2.根据权利要求1所述的增殖培养方法，其特征在于，所述间充质干细胞为从脐带分离而获得的。3.根据权利要求2所述的增殖培养方法，其特征在于，所述的分离的方法以及传代方法为：取健康足月产儿脐带，长度为5～10cm，直径为1～2cm，于高压灭菌的PBS溶液内放置，4℃保存，4h内使用；之后分离华通氏胶，剪成组织块，利用10％FBS培养基培养至细胞融合度达80％以上，胰酶消化后，再用10％FBS培养基培养至细胞融合度达90％以上之后进行传代。4.根据权利要求1所述的增殖培养方法，其特征在于，所述培养基B以DMEM/F12培养基为基础培养基，并添加20μmol白藜芦醇、2.5μmol全反式维甲酸、7μmol尼克酰胺、0.18μmol五肽胃泌素、6μmolL-谷氨酰胺、0.15μmol血小板源性生长因子、1.8μmolL-谷氨酰胺成纤维细胞生长因子、0.4μmol胰高血糖素样肽I。5.根据权利要求1所述的增殖培养方法，其特征在于，所述培养基C以DMEM/F12培养基为基础培养基，并添加22.5μmol白藜芦醇、2.2μmol全反式维甲酸、7μmol尼克酰胺、6μmolL-谷氨酰胺、0.12μmol血小板源性生长因子、1.5μmolL-谷氨酰胺成纤维细胞生长因子、0.08μmol胰岛素样生长因子、0.01μmol激活素A。2CN112094800A说明书1/3页促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，涉及细胞培养技术，具体涉及一种促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法。背景技术[0002]胰岛移植是治疗糖尿病的有效疗法之一，但是胰岛来源不足却严重制约了该疗法的临床应用。利用干细胞强大的自我更新能力以及分化潜能，可解决胰岛来源不足的问题。[0003]现有技术通常比较关注分化细胞数目的多寡，而不重视分化细胞中的胰岛素含量和C-肽含量，使得分化培养技术存在缺陷。目前，现有技术中所得的胰岛β样细胞胞外胰岛素含量仅可达到200多ng/mg的水平。因此，本领域亟需一种可以提高胰岛β样细胞保内外胰岛素含量的方法。发明内容[0004]针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法，本发