用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115820887A(43)申请公布日2023.03.21(21)申请号202211437872.5(22)申请日2022.11.15(71)申请人迪辅乐生物（上海）有限公司地址200335上海市长宁区临虹路3号1号楼(B幢)802室(实际楼层为7层)(72)发明人张姣侯艳敏蒋秋悦陈东波沈阳庾庆华(74)专利代理机构南京行高知识产权代理有限公司32404专利代理师肖念(51)Int.Cl.C12Q1/689(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/23(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表（电子公布）附图6页(54)发明名称用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法(57)摘要本发明公开了用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法，所述绝对荧光定量PCR引物对包括正向引物La129和反向引物La428，所述正向引物La129的序列如SEQIDNO：1所示，所述反向引物La428的序列如SEQIDNO：2所示。本发明还建立了一种嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR检测方法，该方法包括利用所述的引物对进行荧光定量PCR检测。与传统方法相比，荧光定量PCR具有快速、敏感、特异且稳定的优点。其灵敏度比普通PCR高1000倍，能准确、灵敏地检测样品中嗜酸乳杆菌的含量。CN115820887ACN115820887A权利要求书1/1页1.用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对，其特征在于，所述绝对荧光定量PCR引物对包括正向引物La129和反向引物La428，所述正向引物La129的序列如SEQIDNO：1所示，所述反向引物La428的序列如SEQIDNO：2所示。2.一种检测嗜酸乳杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的绝对荧光定量PCR引物对。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质粒La‑pMD19‑T/DH5α，所述质粒的序列如SEQIDNO：3所示。4.权利要求1所述的引物对、权利要求2或3所述的检测试剂盒在检测嗜酸乳杆菌中的应用。5.一种嗜酸乳杆菌的定量检测方法，其特征在，所述定量检测方法采用的是绝对荧光定量PCR方法。6.根据权利要求5所的嗜酸乳杆菌的定量检测方法，其特征在于，所述绝对荧光定量PCR方法具体包括以下步骤：1)以嗜酸乳杆菌的DNA作为扩增模板，使用权利要求1所述引物对进行PCR扩增得到扩增产物；2)利用步骤1)扩增所得的扩增产物，构建重组质粒La‑pMD19‑T/DH5α；3)以构建的La‑pMD19‑T/DH5α重组质粒作为阳性标准品，进行荧光定量PCR反应，制备标准曲线；4)提取待测样品基因组DNA作为模板，与步骤2)的阳性标准品一同进行荧光定量PCR反应，将得到的Ct值代入步骤3)所得标准曲线，从而计算出待测样品中嗜酸乳杆菌的基因拷贝数。7.根据权利要求6所的嗜酸乳杆菌的定量检测方法，其特征在于，步骤1)中，PCR扩增反应体系包括：2×TaqMix12.5μL、ddH2O9.5μL、引物对正反向各1μL、DNA模板1μL；反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸10min。8.根据权利要求6所的嗜酸乳杆菌的定量检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述荧光定量PCR的反应体系包括：DNA模板2μL，权利要求1所述引物对正反向各0.4μL，2×SYBRGreenMasterMix10μL，BSA(20mg/μL)0.2μL，ddH2O7μL；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，反应程序共40个循环；熔解曲线程序：95℃，1min；51℃，30s；95℃，30s。9.根据权利要求6所的嗜酸乳杆菌的定量检测方法，其特征在于，所述待测样品为粪便样品、发酵乳制品、土壤样品、发酵食品、饮料或益生菌产品中的一种或几种。2CN115820887A说明书1/7页用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明属于微生物检测领域，具体涉及用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法。背景技术[0002]嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)属于乳杆菌目(Lactobacillales)乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳杆菌属(Lactobacillus)，是乳酸菌的一种，为革兰氏阳性菌，主要存在于小肠中。嗜酸乳杆菌作为肠道益生菌在维持肠道菌群平衡以及拮抗致病菌方面具有良好的作用，其主要通过分泌代谢产物(