预览加载中,请您耐心等待几秒...
1/10
2/10
3/10
4/10
5/10
6/10
7/10
8/10
9/10
10/10

亲,该文档总共13页,到这已经超出免费预览范围,如果喜欢就直接下载吧~

如果您无法下载资料,请参考说明:

1、部分资料下载需要金币,请确保您的账户上有足够的金币

2、已购买过的文档,再次下载不重复扣费

3、资料包下载后请先用软件解压,在使用对应软件打开

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114592071A(43)申请公布日2022.06.07(21)申请号202210246961.5(22)申请日2022.03.14(71)申请人沈阳农业大学地址110866辽宁省沈阳市沈河区东陵路120号(72)发明人姜宏波刘京慧包杰陈启军(74)专利代理机构沈阳铭扬联创知识产权代理事务所(普通合伙)21241专利代理师吕敏(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)权利要求书1页说明书7页序列表1页附图3页(54)发明名称中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法、试剂盒及引物(57)摘要一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法、试剂盒及引物,属于分子生物学技术领域。具体检检测方法:采集样本;中华小长臂虾微孢子虫DNA的提取;合成扩增片段大小为141bp的上下游引物;绝对荧光定量PCR方法的建立;标准曲线的绘制;绝对荧光定量PCR方法的灵敏度和特异性试验。本发明建立快速,灵敏的中华小长臂虾微孢子虫分子检测方法,与传统的PCR检测方法相比,具有省事、高效、灵敏、定量的特点。CN114592071ACN114592071A权利要求书1/1页1.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的特异性引物,其特征在于:根据中华小长臂虾微孢子虫的靶基因序列,合成扩增片段大小为141bp的上下游引物,所述引物的序列如下:上游引物为:5’‑ATTCCCTCGTTCGTTGAGTCAGATTG‑3’,下游引物为:5’‑GTGGCATTGTCATCATCCCTTTGTTG‑3’,引物浓度有要求为10μM/μL。2.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的试剂盒,其特征在于:包括权利要求1所述的上下游引物以及中华小长臂虾微孢子虫质粒标准品。3.根据权利要求1所述的用于中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的试剂盒,其特征在于:所述中华小长臂虾微孢子虫质粒标准品由Eb99F/Eb99R引物进行扩增得到目的片段制备而成,‑20℃保存。4.如权利要求1‑2任一项所述的引物在中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测中的应用。5.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法,其特征在于:绝对荧光定量PCR方法的建立:使用2×ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix试剂进行绝对荧光定量PCR方法的建立,反应体系为20μL,2×ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix10.0μL,上下游引物各0.4μL,ddH2O7.2μL,模板2μL;加样时先将引物和ddH2O均匀混合并分装到反应管,后加均匀混合好的模板和2×ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix,上机器前离心处理;反应条件为:预变性95℃30s,1个循环;变性95℃10s,退火60℃30s,延伸72℃30s,40个循环。6.根据权利要求5所述的一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法,其特征在于:所述荧光定量PCR标准曲线的绘制:(1)制备含扩增靶序列的阳性质粒作为阳性标准品;(2)将构建标准重组质粒换算拷贝数后,进行连续的10倍梯度稀释,从7.7×100到7.7×108共设置9个浓度梯度,每个梯度设置6个重复,于荧光定量PCR仪中进行扩增,各取2μL当做模板,同时设置以ddH2O为模板为阴性对照;(3)扩增结束后收集数据,根据扩增屈曲线、Ct值,每个浓度重复3次进行检测,得出最佳的检测区间,并绘制标准曲线。2CN114592071A说明书1/7页中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法、试剂盒及引物技术领域[0001]本发明属于分子生物学技术领域,特别是涉及一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法、试剂盒及特异性引物。背景技术[0002]微孢子虫最早被报道于1857年,(Nageli1857),是典型的专性胞内寄生的单细胞真核生物,微孢子虫自身具有着独特的特征,如独特的侵染装置,孢子发芽时弹出极丝,将具有感染性的胞原质运输到细胞内。国际动物命名委员会(ICZN)已确定微孢子虫门包括200多个属(Becneletal.,2014)。Thelohania属侵染直额长臂虾(Palaemonrectirostris)、锯齿长臂虾(Palaemonserratus)和海洋褐虾(Crangonvulgaris)和淡水龙虾和奥斯塔欧洲鳌虾(Astacusfluviatilis)等虾类(EdgertonBFetal,2002;StentifordGDetal,2013)。[0003]Enterocytosporaartemiae(EAM