用于检测阪崎肠杆菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量PCR试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108179208A(43)申请公布日2018.06.19(21)申请号201810205116.7(22)申请日2018.03.13(71)申请人苏州百源基因技术有限公司地址215163江苏省苏州市苏州高新区科技城锦峰路8号(72)发明人徐红车团结陈游高恺李亚鹏(74)专利代理机构北京中恒高博知识产权代理有限公司11249代理人吕玉博(51)Int.Cl.C12Q1/689(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/01(2006.01)权利要求书1页说明书11页序列表2页附图6页(54)发明名称用于检测阪崎肠杆菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量PCR试剂盒(57)摘要本发明提供用于检测阪崎肠杆菌的特异性引物和探针，所述探针序列为：5’-CGTTCAGGAGAGCCACCG-3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’-GAACTGACCGATGACGTA-3’；下游引物序列为5’-GTCTCATTAAACGGCTCG-3’。本发明还提供相应的实时荧光PCR试剂盒。本发明提供特异性引物和探针，通过提取阪崎肠杆菌的基因组DNA，结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中阪崎肠杆菌含量的目的，具有高灵敏度和高特异性，对判断阪崎肠杆菌活性菌的含量以至于后续研究泌尿道感染具有重要意义。CN108179208ACN108179208A权利要求书1/1页1.用于检测阪崎肠杆菌的特异性引物和探针，其特征在于：所述探针序列为：5’-CGTTCAGGAGAGCCACCG-3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’-GAACTGACCGATGACGTA-3’；下游引物序列为5’-GTCTCATTAAACGGCTCG-3’。2.根据权利要求1所述的特异性引物和探针，其特征在于：探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。3.根据权利要求1所述的特异性引物和探针，其特征在于：所述上游引物和所述下游引物为向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。4.一种用于检测阪崎肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的特异性引物和探针。5.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：在20μlPCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.2μl，所述下游引物的用量为0.2μl，所述探针的用量为0.2μl。6.根据权利要求4或5所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括系列浓度标准品和阳性对照；所述系列浓度标准品是将阪崎肠杆菌16SrDNA基因与载体连接，转化至感受态细胞中诱导表达，提取重组质粒，将重组质粒定量后稀释，得到系列浓度标准品。7.根据权利要求6所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述标准品的核苷酸序列为序列表中序列2。8.权利要求1-3任一所述的特异性引物和探针、权利要求4-7任一所述的实时荧光定量PCR试剂盒在如下任一中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的：(1)定性或定量检测或辅助检测阪崎肠杆菌；(2)制备定性或定量检测或辅助检测阪崎肠杆菌的产品。9.一种检测或辅助检测待检样品中是否含有阪崎肠杆菌的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于：分别以系列浓度标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃10秒、60℃30s并收集荧光信号，40个循环。2CN108179208A说明书1/11页用于检测阪崎肠杆菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量PCR试剂盒技术领域[0001]本发明属于分子生物学和体外诊断试剂技术领域，具体涉及用于检测阪崎肠杆菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量PCR试剂盒。背景技术[0002]阪崎肠杆菌(Cronobactersakazakii)是肠杆菌科的一种，属革兰氏阴性、不会形成孢子而呈棒状的细菌，最适宜在37℃至43℃之间生长。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50％以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。传统的诊断阪崎肠杆菌的方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，需要大量的时间进行生理生化反应的结果判定，不利于及时找到病原，诊断病因。PCR技术作为