一种二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体及其构建方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN101935350A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN101935350A(43)申请公布日2011.01.05(21)申请号201010236956.3C12N15/70(2006.01)(22)申请日2010.07.23G01N33/53(2006.01)(71)申请人广东药学院地址510006广东省广州市大学城外环东路280号(72)发明人李黄金陈伟赵林柴伟佳唐伟(74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102代理人陈卫(51)Int.Cl.C07K16/44(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表5页附图2页(54)发明名称一种二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体及其构建方法和应用。本发明抗氯霉素单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本发明以抗氯霉素抗体可变区基因为模板，通过引物突变PCR在轻链和重链的可变区分别加入一个半胱氨酸定点突变，以重叠延伸PCR组装成二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体基因，通过引物突变PCR在基因的5’端30bp序列内引入同义突变后，将基因转导入大肠杆菌表达系统中，表达的蛋白即为二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体。本发明抗氯霉素单链抗体通过模拟天然抗体的结构，在单链抗体的基础上引入一对二硫键的构建形式，可以提高抗体的稳定性。本发明二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体可以取代单克隆抗体用于氯霉素残留检测。CN10935ACN101935350A权利要求书1/1页1.一种二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种编码权利要求1所述二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体的cDNA，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。3.权利要求1所述二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体的构建方法，其特征在于是以抗氯霉素抗体可变区基因为模板，通过引物突变PCR在轻链和重链的可变区分别加入一个半胱氨酸定点突变，以重叠延伸PCR组装成二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体基因，再通过引物突变PCR在目的基因的5’端30bp序列内引入同义突变，以降低该序列内的GC含量，将该基因转导入大肠杆菌表达系统中，表达的蛋白即为二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体。4.一种试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包含权利要求1所述二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体。5.权利要求1所述二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体在残留氯霉素的检测中的应用。2CN101935350A说明书1/5页一种二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明涉及氯霉素抗体领域，具体涉及一种二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体及其构建方法和应用。背景技术[0002]氯霉素(CAP)是一种可引起人类再生障碍性贫血粒状白细胞缺乏症等严重疾病的抗生素，自1994年起便被联合国禁止使用，我国亦自2002年起明确规定动物源性食品中氯霉素残留不得检出(王伊琴，包勇敢，胡烈山，等.ELISA在检测动物组织氯霉素残留中的应用[J].中国农业通报，2006，22(4)：26-29.)，但由于廉价高效，目前仍被广泛非法滥用于养殖业，给人民生命健康和我国动物源性食品相关产品的出口贸易带来了较大的挑战。特异性抗体在食品有害残留检测中具有重要意义，高质量的抗体是食品有害残留样品的制备和检测的关键试剂(周宏琛，闫秋成，田晓林，等.动物源性食品安全快速检测与酶联免疫吸附方法的应用[J].肉品卫生，2005，25(11)：29-32.)。单克隆抗体(MAb)具有特异性强和亲和力高的优点，但其现有生产技术存在生产成本高、规模难于工业放大和质控等缺点。基因工程小分子抗体是单克隆抗体的理想替代产品，目前已有众多兽药和农药类小分子半抗原的基因工程抗体的报道(YAUKY，LEEH，HALLJC.etal.Emergingtrendsinthesynthesisandimprovementofhapten-specificrecombinantantibodies[J].BiotechnologyAdvances，2003，21：599-637.、KRAMERK，HOCKB.Recombinantantibodiesforenvironmentalanalysis[J].Anal.Bioanal.Chem.2003，377，417-426.、HOOGENBOOMHR.Selectingandscreeningrecombinantantibodylibraries[J].Nature2005，23，1105-1116.)。单链抗体(scFv)是一种以柔性接头连接抗体重链和轻链可变区的小分子基因工程抗体，该类抗体既保留了母本抗体的亲和