一种白血病单链抗体库及其构建方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CN102978713B(45)授权公告日(45)授权公告日2015.02.25(21)申请号201210484448.6(56)对比文件CN101210241A,2008.07.02,权利要求(22)申请日2012.11.231-3.(73)专利权人浙江大学CN1293206A,2001.05.02,全文.地址310027浙江省杭州市西湖区浙大路范娜娜等.单克隆抗体药物与血液系统恶性38号肿瘤的治疗.《中国细胞生物学学报》.2011,第(72)发明人詹金彪范娜娜张珍珍林莉33卷(第9期),1015-1021.汤沁代争审查员田颖(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司33200代理人张法高赵杭丽(51)Int.Cl.C40B40/10(2006.01)C12N15/13(2006.01)C12N15/63(2006.01)A61K39/395(2006.01)A61P35/02(2006.01)权利要求书1页说明书16页序列表12页附图4页(54)发明名称一种白血病单链抗体库及其构建方法和应用(57)摘要本发明提供一种白血病噬菌体单链抗体库，以噬菌粒pCANTAB-5E为载体，库容达到1.5×109，经DNA测序证明其多样性良好。从该全人源白血病单链抗体库中，通过噬菌体展示技术，以特定的白血病相关抗原为靶标，经过多轮淘筛，可以方便地获得白血病细胞特异的全人源单链抗体。本发明提供的抗体库的库容量大，多样性良好；包含全套人类单链抗体的组合；单链抗体由重链可变区VH和轻链可变区VL通过连接肽(GGGGS)3连接而成，且含有完整的抗原结合部位。所述方法可操作性强，库容量大，可方便地筛选出对白血病特异的全人源单链抗体，这些全人源单链抗体可制备为靶向药物，用于白血病的治疗。CN102978713BCN102978713B权利要求书1/1页1.一种白血病单链抗体库，其特征在于：该抗体库含有全套人类抗体重链可变区VH和轻链可变区VL，及中间连接区linker序列为(GGGGS)3，有完整的抗原结合部位，以噬菌粒pCANTAB-5E为载体，库容达到1.5×109；所述抗体库通过以下步骤实现：（1）总RNA提取和cDNA的合成：取白血病患者的血液，分离淋巴细胞，用裂解液裂解淋巴细胞，提取细胞总RNA，经逆转录PCR逆转录为cDNA；（2）用PCR方法扩增抗体重链和轻链可变区基因：根据人类抗体基因序列，分别设计PCR扩增抗体重链、轻链可变区所需的特定引物，共32条，序列如SEQIDNO.1-32所示；以步骤（1）获得的cDNA为模板，用PCR方法扩增可变区基因VH和VL，包括Vκ和Vλ；（3）单链抗体scFv基因片段的组装和全长扩增：设计含有由四个甘氨酸和一个丝氨酸组成的重复3次的连接肽序列和酶切位点SfiI、NotI的引物，在上述扩增的重链VH和轻链VL可变区基因的基础上，再经重叠PCR获得scFv基因；（4）重组噬菌粒的构建：分别用SfiI、NotI双酶切scFv基因片段，将其插入噬菌粒载体pCANTAB-5E，构建重组噬菌粒，转化感受态E.coliTGl，经辅助噬菌体M13K07超感染，获得单次的噬菌体抗体库，经重复转化后，获得全人源白血病单链抗体库，库容达到1.5×109；（5）单链抗体库的多样性分析：随机挑取多个单克隆菌，测定插入区scFv基因的DNA序列，经ClustaIW序列比对软件分析其序列的相似性，判断单链抗体库的多样性分析，证明其多样性良好；其中构建抗体库的步骤（3）所述连接肽序列和酶切位点SfiI、NotI的引物序列如SEQIDNO.33-64所示。2.根据权利要求1所述的一种白血病单链抗体库在制备白血病抗体药物中的应用，其特征在于通过以下步骤实现：用白血病相关抗原作为靶抗原，用噬菌体展示的方法，筛选全人源白血病单链抗体库，经过四轮“吸附-洗脱-扩增”的淘筛过程，筛选出抗白血病的特异性单链抗体，制备白血病抗体药物。2CN102978713B说明书1/16页一种白血病单链抗体库及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明属基因工程，涉及一种全人源白血病单链抗体库和其构建方法，及其在制备白血病抗体药物中的应用。背景技术[0002]自和Milstein创立淋巴细胞杂交瘤技术至今，单克隆抗体在肿瘤的诊断和治疗领域得到了广泛的应用。第一代应用于人类疾病治疗的主要是鼠源性单抗，但是鼠单抗的主要缺点是引起人体免疫反应，人体产生的人抗鼠抗体使其很快清除，不能很好的发挥其生物学功能，因此在临床应用中受到限制；第二代抗体是在鼠单抗基础上，通过基因重组形成了嵌合式抗体和人源化抗体，但两者应用于人体依旧存在免疫原性问题；目前，人们正致力于第三代抗体即全人源性单克隆