呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103801110103801110A(43)申请公布日2014.05.21(21)申请号201210439205.0(22)申请日2012.11.07(71)申请人江苏维赛科技生物发展有限公司地址212009江苏省镇江市丁卯经十五路国家科技核心区99号B11栋3层(72)发明人杜道林曾昆(51)Int.Cl.B01D15/38(2006.01)B01J20/281(2006.01)G01N1/34(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书3页说明书3页附图1页附图1页(54)发明名称呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法(57)摘要本发明公开了一种基于呕吐毒素单克隆抗体的免疫亲和柱的制备方法。通过细胞融合所得到的单克隆抗体与溴化氰活化的琼脂糖4B偶联得到的免疫亲和吸附剂填充与固相萃取管中得到了可以特异性吸附呕吐毒素的免疫亲和柱。本发明制备的免疫亲和柱能特异性的与呕吐毒素结合，最大结合容量约为240ngDON；重复使用三次，回收率不低于90%。本发明可用于谷物及谷物制品检测呕吐毒素残留的前处理方法。CN103801110ACN1038ACN103801110A权利要求书1/1页1.一种呕吐毒素免疫亲和柱的制备，其特征在于，是由固相载体和预期偶联的呕呕吐毒素单克隆抗体组成，具体步骤为：（1）偶联：取纯化后的呕吐毒素单克隆抗体与溶胀后的CNBr-Sepharose4B凝胶共同放置于偶联缓冲液中，室温下震荡偶联；（2）封闭：在偶联凝胶产物中加入其5～10倍体积的封闭缓冲液，室温下震荡反应2h；（3）洗涤：分别用5～10倍封闭后凝胶体积的醋酸盐缓冲液和Tris-HCL缓冲液交替洗涤3次，然后用5～10倍封闭后凝胶体积的PBS缓冲液洗涤2次，制备得到免疫亲和吸附剂；（4）装柱：将得到的免疫亲和吸附剂填充到固相萃取柱中，加入PBS缓冲液后自然沉降，得到呕吐毒素免疫亲和柱，4度保存待用。2.根据权利要求1所述的呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的固相载体为CNBr-Sepharose4B。3.根据权利要求1所述的呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的呕吐毒素单克隆抗体与CNBr-Sepharose4B干粉的质量比为1：80；所述的偶联缓冲液为0.1mol/LNaHCO3溶液；溶解CNBr-Sepharose4B干粉的缓冲液为1.0mmol/LHCL。4.根据权利要求1所述的呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的封闭缓冲液为0.1mol/LTris-HCL（pH8.0），以封闭未偶联的活化位点。5.根据权利要求1所述的呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于其中步骤（3）中所述的醋酸盐缓冲液为0.1mol/L、pH4.0的醋酸盐缓冲液；所述Tris-HCL缓冲液为0.1mol/L、pH8.0的Tris-HCL缓冲液。6.呕吐毒素免疫亲和柱可用于谷物及谷物制品检测呕吐毒素残留的前处理方法。2CN103801110A说明书1/3页呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法技术领域[0001]本发明属于检测技术领域，具体地涉及涉及一种呕吐毒素的免疫亲和柱的制备方法。背景技术[0002]呕吐毒素，又称脱氧雪腐镰刀菌炼醇（Deoxynivalenol，DON），是于1970年从被禾谷镰刀菌污染的玉米中分离出来的一种能引起呕吐的毒素，主要由禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）产生，属单端孢霉炼族化合物B型。对热比较稳定，一般的烹调和加热都不能破坏其毒性，对碱性环境比较敏感，用碳酸钠溶液洗涤粮食，可以除掉70%左右的DON。[0003]动物DON中毒后表现为呕吐，食欲减退，体重下降，流产，弱仔和死胎，死亡率增高。人类DON中毒后会出现恶心、呕吐、胃部不适、腹痛、腹泻、头痛、头暈，还可能有口干、全身无力的症状，少数患者会出现颜面潮红、发烧。DON还具有很强的致癌、致畸、致突变的毒性、免疫毒性等危害，已被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)确定为最危险的自然发生食品污染物之一。1998年，在国际癌症研究机构公布的评价报告中，呕吐毒素被列为三类致癌物。[0004]许多国家已制定了谷物中呕吐毒素的限量标准，美国制定供人类食用的小麦呕吐毒素允许限量≤2mg/kg，欧盟规定谷粉及玉米粉中允许限量≤0.75mg/kg。我国GB2715-2005《粮食卫生标准》中规定小麦、大麦、玉米及其成品粮中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量为1000μg/kg，GB2761-2005《食品中真菌毒素限量》规定小麦和玉米的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量为1000μg/kg。[0005]目前呕吐毒素常用的检测多为仪器检测方法，如高效液相色谱法、液质联用（LC-MS