呕吐毒素及其衍生物适配体亲和柱及其制备方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109833648A(43)申请公布日2019.06.04(21)申请号201910046653.6(22)申请日2019.01.15(71)申请人北京农业质量标准与检测技术研究中心地址100097北京市海淀区曙光花园中路9号北京市农林科学院种子大厦1005(72)发明人栾云霞刘洪美陆安祥付海龙郭晓军冯晓元(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君黄爽(51)Int.Cl.B01D15/38(2006.01)B01J20/281(2006.01)G01N1/34(2006.01)权利要求书2页说明书7页序列表1页附图2页(54)发明名称呕吐毒素及其衍生物适配体亲和柱及其制备方法与应用(57)摘要本发明提供呕吐毒素及其衍生物适配体亲和柱及其制备方法与应用。所述亲和柱以N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将能够高亲和力、高特异性识别样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的核酸适配体与载体进行共价偶联，偶联后的适配体复合载体装填亲和柱。所述亲和柱主要用于食品、饲料、牛奶、粮食作物以及中药等其他多种样本中呕吐毒素及其衍生物的纯化及净化，以利于后期对样本中此类毒素的高效液相色谱和快速检测。一次过柱可以净化富集4种毒素，重复使用次数可达到15次，回收率在80％以上，降低了成本，提高了样品的前处理效率。CN109833648ACN109833648A权利要求书1/2页1.呕吐毒素及其衍生物特异性DNA适配体，其特征在于，核酸序列如SEQIDNO:1所示；其中，呕吐毒素的衍生物包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇。2.含有权利要求1所述适配体的检测试剂、检测试纸条、检测试剂盒或亲和柱。3.权利要求1所述适配体的以下任一应用：(1)在制备呕吐毒素及其衍生物适配体亲和柱中的应用；(2)在制备呕吐毒素及其衍生物的检测试剂、检测试纸条或检测试剂盒中的应用；(3)在呕吐毒素及其衍生物检测中的应用；其中，呕吐毒素的衍生物的定义同权利要求1中所述。4.呕吐毒素及其衍生物适配体亲和柱，其特征在于，所述亲和柱的填料是以N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将权利要求1所述适配体与载体进行共价偶联得到的；其中，呕吐毒素的衍生物的定义同权利要求1中所述。5.根据权利要求4所述的亲和柱，其特征在于，所述适配体是经过化学修饰的适配体序列，修饰方式包括氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰或生物素修饰。6.根据权利要求5所述的亲和柱，其特征在于，所述适配体是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-或C6间接臂-(CH2)6-，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，得到氨基修饰的适配体。7.权利要求6所述亲和柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖的制备：将琼脂糖与等体积水混合，并加入配备有pH电极和磁力搅拌器的反应器中，按每毫升琼脂糖溶液50mgN-羟基琥珀酰亚胺的量向上述琼脂糖溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺，将反应体系的pH值控制在9±0.1，于20℃±5℃反应3～l2min；反应结束后，将等体积冰屑迅速加入到上述反应液中，并迅速倾入布氏漏斗，用琼脂糖溶液体积10～15倍量的冷缓冲液抽滤洗涤，干燥即得颗粒状的N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖；其中，所述缓冲液为：200mMNa2HPO4，5mMMgCl2，pH8.0；2)载体的溶胀和洗涤：以N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，将50mg载体颗粒用1mM盐酸1-5mL浸泡0.5-1h进行溶胀；溶胀后的载体用1mM盐酸洗涤3-6次，每次盐酸用量1-5mL，然后用蒸馏水洗涤2-5次，每次蒸馏水用量1-5mL，最后用Na2HPO4缓冲液洗涤2-5次，每次缓冲液用量1-5mL；3)适配体复性：取1-5OD的3’或5’端氨基修饰的适配体溶解于Na2HPO4缓冲液200-1000μL中，于75-95℃复性3-5min，然后室温放置15-60min；4)偶联：向步骤2)洗涤后的载体中加入步骤3)复性好的适配体溶液200-1000μL，于20℃-30℃摇床震荡过夜；5)封闭：步骤4)所得偶联产物依次用200mMpH8.0的Na2HPO4水溶液洗涤2-5次，每次1-5mL，然后用0.1MpH8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤2-5次，每次1-5mL，然后加入0.1MpH8.0的Tris-HCl溶液2-5mL，于30℃摇床震摇反应1-6h，封闭剩余活性位点，得到载体-适配体偶联胶；6)洗涤：