一种伏马毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN104181300104181300A(43)申请公布日2014.12.03(21)申请号201310188358.7(22)申请日2013.05.21(71)申请人北京华安麦科生物技术有限公司地址102200北京市昌平区科技园区超前路6号(72)发明人柳家鹏张彦明孟丽敏徐家兰(51)Int.Cl.G01N33/577(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书5页说明书5页附图1页附图1页(54)发明名称一种伏马毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途(57)摘要本发明涉及一种伏马毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途。该免疫亲和纯化柱利用蛋白G偶联到琼脂糖凝胶载体上，然后用抗伏马毒素的抗体与琼脂糖上的蛋白G偶联。偶联后的伏马毒素抗体-蛋白G-琼脂糖凝胶载体复合载体装填亲和柱。该免疫亲和柱主要用于对于食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的伏马毒素的纯化，以便于后期对样本中伏马毒素的高效液相色谱(HPLC)检测和荧光检测。CN104181300ACN10483ACN104181300A权利要求书1/1页1.一种伏马毒素的免疫亲和柱，其特征在于包含有载体、蛋白G和伏马毒素抗体。2.根据权利要求1中所述的免疫亲和柱，其特征在于蛋白G通过化学键偶联在载体上，伏马毒素抗体与蛋白G结合后用交联剂交联。3.根据权利要求1中所述的免疫亲和柱，其特征在于蛋白G是基因重组表达的蛋白G。4.根据权利要求2中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的蛋白G包括按照GenBankCAA27638.1序列表达的蛋白G，以及进过序列优化后表达的蛋白G。5.根据权利要求3中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的序列优化的蛋白G，包括针对大肠杆菌表达进行的蛋白G密码子进行优化、对蛋白G进行抗体结合区域进行序列改变以增加亲和力以及增加蛋白G基因序列中抗体结合区域数量以提高抗体亲和能力。6.根据权利要求1中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的载体是琼脂糖凝胶。7.根据权利要求6中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的琼脂糖凝胶包含但不限于溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶以及纤维素。8.根据权利要求6中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的抗伏马毒素抗体包括单克隆IgG抗体和多克隆抗体。9.一种纯化伏马毒素的免疫亲和柱制备方法，其特征在于1)琼脂糖sepharose4B，加入0.8M的NaOH，30％的环氧氯丙烷，2mg/ml的硼氢化钠NaBH4，，在25℃下摇床反应8小时进行活化。或者购买溴化氰活化的sepharose4B。2)每克活化的sepharose4B加入30-200nmol的蛋白G，在0.1MNaHCO3，0.5MNaClPH8.8的缓冲液中，室温偶联2小时。或者4℃偶联过夜。3)偶联产物用1MTris.HClPH8.0室温反应2小时。4)偶连好的sepharose-蛋白G，用20mMPH7.4的PBS洗涤。5)将伏马毒素抗体溶解在同样的20mMPH7.4的PBS中，每克蛋白G-sepharose加入200nmo1-1.2umol抗体。室温反应30分钟。6)将伏马毒素抗体-蛋白G-sepharose载体用20mMPBSPH7.4洗涤，然后加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，PH8.3.室温反应1小时。7)用20mMPH7.4的乙醇胺终止反应，用含有0.01％硫柳汞的10mMPBSPH7.4洗涤伏马毒素抗体-蛋白G-sepharose载体。装柱，放于4℃保存。10.根据权利要求1所述的免疫亲和柱检测伏马毒素的用途。11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：包含但不限于粮食、饲料、牛奶及乳制品、水产、血液、尿液、水中伏马毒素的分离纯化。2CN104181300A说明书1/5页一种伏马毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途技术领域：[0001]本发明涉及一种伏马毒素的免疫亲和柱及其制备方法和用途。属食品安全检测领域。背景技术：[0002]伏马毒素(Fumonisins)是一组主要由串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)在一定温度和湿度条件下繁殖所产生的真菌毒素。伏马毒素在自然界中分布广泛，且危害性大，逐渐引起了国内外学者的高度重视。目前，已发现的伏马毒素结构类似物主要分为A、B、C、P四类。研究证实伏马毒素可致马大脑白质软化症(EL-EM)，神经性中毒而表现意识障碍、失明和运动失调等症状，严重者甚至造成死亡。对猪造成肺水肿综合征(PPE)，并能造成肝脏和食道损伤。伏马毒素还可引起灵长类动物的动脉粥样硬化样改变，诱发大鼠肝癌。与人类食道癌的发生也密切相关。国际癌症研究机构与加利福尼亚