T-2毒素免疫亲和柱的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103801111103801111A(43)申请公布日2014.05.21(21)申请号201210443317.3(22)申请日2012.11.08(71)申请人江苏维赛科技生物发展有限公司地址212009江苏省镇江市丁卯经十五路国家科技核心区99号B11栋3层(72)发明人杜道林洪霞杜霞(51)Int.Cl.B01D15/38(2006.01)B01J20/281(2006.01)G01N1/34(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书3页说明书3页附图1页附图1页(54)发明名称T-2毒素免疫亲和柱的制备方法(57)摘要本发明公开了一种基于T-2毒素单克隆抗体的免疫亲和柱的制备方法。通过细胞融合所得到的单克隆抗体与溴化氰活化的琼脂糖4B偶联得到的免疫亲和吸附剂填充与固相萃取管中得到了可以特异性吸附T-2毒素的免疫亲和柱。本发明制备的免疫亲和柱能特异性的与T-2毒素结合，最大结合容量约为240ngT-2；重复使用三次，回收率不低于90%。本发明可用于谷物及谷物制品检测T-2毒素残留的前处理方法。CN103801111ACN1038ACN103801111A权利要求书1/1页1.一种T-2毒素免疫亲和柱的制备，其特征在于，是由固相载体和预期偶联的T-2毒素单克隆抗体组成，具体步骤为：（1）偶联：取纯化后的T-2毒素单克隆抗体与溶胀后的CNBr-Sepharose4B凝胶共同放置于偶联缓冲液中，室温下震荡偶联；（2）封闭：在偶联凝胶产物中加入其5～10倍体积的封闭缓冲液，室温下震荡反应2h；（3）洗涤：分别用5～10倍封闭后凝胶体积的醋酸盐缓冲液和Tris-HCL缓冲液交替洗涤3次，然后用5～10倍封闭后凝胶体积的PBS缓冲液洗涤2次，制备得到免疫亲和吸附剂；（4）装柱：将得到的免疫亲和吸附剂填充到固相萃取柱中，加入PBS缓冲液后自然沉降，得到T-2毒素免疫亲和柱，4度保存待用。2.根据权利要求1所述的T-2毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的固相载体为CNBr-Sepharose4B。3.根据权利要求1所述的T-2毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的T-2毒素单克隆抗体与CNBr-Sepharose4B干粉的质量比为1：80；所述的偶联缓冲液为0.1mol/LNaHCO3溶液；溶解CNBr-Sepharose4B干粉的缓冲液为1.0mmol/LHCl。4.根据权利要求1所述的T-2毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于所述的封闭缓冲液为0.1mol/LTris-HCL（pH8.0），以封闭未偶联的活化位点。5.根据权利要求1所述的T-2毒素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于其中步骤（3）中所述的醋酸盐缓冲液为0.1mol/L、pH4.0的醋酸盐缓冲液；所述Tris-HCL缓冲液为0.1mol/L、pH8.0的Tris-HCL缓冲液。6.T-2毒素免疫亲和柱可用于谷物及谷物制品检测T-2毒素残留的前处理方法。2CN103801111A说明书1/3页T-2毒素免疫亲和柱的制备方法技术领域[0001]本发明属于检测技术领域，具体地涉及涉及一种T-2毒素的免疫亲和柱的制备方法。背景技术[0002]T-2毒素（T-2toxin）属于单端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)中的A族，是镰刀菌属(Fusarium)的部分菌种生成的一组结构相似的化合物中毒性最强的毒素之一，主要污染谷物及其制品，结构为白色针状结晶，熔点为150-151℃，难溶于水，易溶于极性溶剂，如三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯等。[0003]单端孢霉烯族毒素对小麦黄化芽鞘和胚根的生长有强生物活性，能够抑制小麦的生长，并导致芽鞘、胚根变色溃烂。1989年，王裕中等测定了禾谷镰刀菌产生的不同种毒素对不同种小麦黄化芽鞘的生物活性，其中DON对黄化芽鞘生长具有很高的抑制率，是活性最强的毒素之一。除了以上列举的毒素对植物的危害外，单端孢霉烯族毒素还对人和动物有很大的危害，如常食用的食物如肉、奶、蛋中均有真菌毒素及其代谢物残留，而且由于单端孢霉烯族毒素具有较强抗热能力，不会因加热而破坏，所以烹饪也不能解决，如果人畜食用了带毒的粮食或饲料后，可发生不同种类和程度中毒症状。临床表现为嗜睡、呕吐、食欲丧失、免疫功能障碍、胃肠功能障碍和繁殖功能障碍等。[0004]1999年，启东华宝三联牧场饲料由于使用污染的原料，致使多头猪病死，后来发现主要原因就是赤霉菌产生了的大量F-2毒素(类雌激素)及一定量的T-2毒素，引起了猪机体激紊乱，内环境不平衡，内脏出血性损害或消化系统伤害，致使抵抗力下降，机体易感各种疾病，最后导致死亡，2008年，美国也出现了由于T-2毒素的污染导致的