一种艾塞那肽高效分离纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN104250298104250298A(43)申请公布日2014.12.31(21)申请号201310256359.0(22)申请日2013.06.25(71)申请人浙江华谱新创科技有限公司地址317503浙江省台州市温岭市滨海镇金港开发区滨港路1号(72)发明人周永正秦永杰张慧(74)专利代理机构沈阳晨创科技专利代理有限责任公司21001代理人张晨(51)Int.Cl.C07K14/575(2006.01)C07K1/20(2006.01)C07K1/18(2006.01)权权利要求书2页利要求书2页说明书6页说明书6页附图1页附图1页(54)发明名称一种艾塞那肽高效分离纯化方法(57)摘要本发明的目的在于提供一种具有高选择性的艾塞那肽纯化分离方法，该方法采用二维的分离纯化方法：采用极性共聚的方法将具有特异性的静电作用引入到没有特异性的单纯依靠疏水作用的反相色谱中，即反相/阴离子交换（RP/SAX）混合模式和反相/阳离子交换（RP/SCX）混合模式，并通过对缓冲盐种类、浓度、pH条件的优化以及流动相梯度条件的优化，使样品具有适当的保留，并且可以达到良好分离。CN104250298ACN1042598ACN104250298A权利要求书1/2页1.一种艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于，采用二维正交分离纯化体系对艾塞那肽粗品进行分离纯化，采用极性共聚的方法将具有特异性的静电作用引入到没有特异性的单纯依靠疏水作用的反相色谱中，即RP/SAX混合模式和RP/SCX混合模式。2.按照权利要求1所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于：所述RP/SAX混合模式色谱中，RP为直链正烷基结构，SAX为一种季铵基基团，RP/SAX的结构式为式Ⅰ：其中，R1为C2～C6的烷基中的一种，R2为C1～C8的烷基中的一种；所述RP/SCX混合模式色谱中，RP为直链正烷基结构，SCX为一种磺酸基基团，RP/SCX的结构式为式Ⅱ：其中R3为C1～C6烷基中间的一种，R4为C1～C8烷基或苯基的一种。3.按照权利要求2所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于：在RP/SAX混合模式色谱中，直链正烷基结构与季铵基比例为1:100～100:1在RP/SCX混合模式色谱中，直链正烷基键合基团与磺酸基键合基团的比例为1:100～100:1。4.按照权利要求1、2或3所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于：所述二维正交分离纯化体系中，第一维使用反相/阴离子交换分离纯化体系，即RP/SAX；第二维使用反相/阳离子交换分离纯化体系，即RP/SCX。5.按照权利要求4所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于：第一维分离纯化体系流动相为，A相：缓冲盐，B相：水，C相：高氯酸钠，D相：乙腈。6.按照权利要求5所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于，在第一维分离纯化体系中：A相缓冲盐选自a、b或c，其中：2CN104250298A权利要求书2/2页a、磷酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH5.0-8.0；b、甲酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH5.0-8.0；c、乙酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH5.0-8.0；C相高氯酸钠水溶液的浓度为100-1000mM；D相乙腈含量变化特征在于：0-240min，5%～80%。7.按照权利要求4所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于：第二维分离纯化体系流动相为，A相：缓冲盐，B相：水，C相：高氯酸钠，D相：乙腈。8.按照权利要求7所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于：在第二维分离纯化体系中：A相缓冲盐选自a、b或c，其中：a、磷酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH2.0-5.0；b、甲酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH2.0-5.0；c、乙酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH2.0-5.0；C相高氯酸钠水溶液的浓度为100-1000mM；D相乙腈含量变化特征在于：0-240min，5%～80%。9.按照权利要求1～3、5～8任一所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法其色谱操作参数如下：进样量：100μL-1000mL；流速：0.5-300.0mL/min；柱温：15-60°C；色谱柱内径：4.6-100mm；色谱柱柱长：250-1000mm。10.按照权利要求1～3、5～8任一所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于具体步骤如下：1）、称取适量艾塞那肽粗品，用Tris盐-甲醇溶解，配制成浓度为100mg/mL的溶液，用0.22m滤膜过滤，待用；2）、一维使用阴离子交换-反相分离：色谱柱内径4.6-100mm，色谱柱柱长：250-1000mm，流速0.5-300.0