一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112500473A(43)申请公布日2021.03.16(21)申请号202011296775.XC07K1/18(2006.01)(22)申请日2020.11.18(71)申请人李荣光地址234000安徽省宿州市埇桥区苗安乡梨园村老庄组4号(72)发明人李荣光(74)专利代理机构北京和信华成知识产权代理事务所(普通合伙)11390代理人胡阔雷(51)Int.Cl.C07K14/575(2006.01)C07K1/14(2006.01)C07K1/36(2006.01)C07K1/34(2006.01)C07K1/20(2006.01)权利要求书2页说明书7页(54)发明名称一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法(57)摘要本发明公开了一种艾塞那肽的分离纯化方法，具体涉及一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法，包括以下步骤：粗肽的预处理，溶样，粗纯，离子交换，换盐，冻干。将艾塞那肽粗肽进行超声溶解经滤膜过滤后利用高效液相色谱法上样进行粗纯，收集粗纯后纯度大于90％以上的部分进行离子交换，离子交换后收集其中纯度大于95％以上的部分进行换盐，将换盐之后的合格纯品进行浓缩冻干。本发明改进了传统方法纯化艾塞那肽的弊端，将离子交换放在粗纯之后进行，给后续的提纯过程提供了便利，且具有良好的分离效果，在粗纯流动相采用磷酸替代传统的三氟乙酸，纯化效果更优，整个纯化过程所用时间更少，收率更高，为大规模纯化醋酸艾塞那肽提供了方向。CN112500473ACN112500473A权利要求书1/2页1.一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)粗肽的预处理先将艾塞那肽粗肽进行自然晾干，使其切割过程中残留的溶剂挥发，晾干后将粗粗肽溶解后利用高效液相色谱仪进行粗肽分析，根据粗肽的分析图谱可以知道艾塞那肽的出峰浓度以及杂质的分布情况；(2)溶样按照固液比1g艾塞那肽粗肽：18mL去离子水：2mL乙腈将经过自然晾干的艾塞那肽粗肽超声溶解，超声时间为5‑10min，溶解完全后用滤膜进行过滤，收集滤液；(3)粗纯利用反向液相色谱法对滤液进行粗纯，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A1是体积分数0.05％‑0.2％的磷酸水溶液，流动相B1是体积分数0.05％‑0.2％磷酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的艾塞那肽溶液取小样进行分析，将其中纯度大于90％的一段溶液收集待用；(4)离子交换将步骤(3)中粗纯后收集的溶液进行离子交换，填料为SP高流速琼脂糖微球的强阳离子交换柱，流动相A2为0.02mol/LpH值为3.5～4.4的醋酸‑醋酸钠水溶液，流动相B2为含有0.5mol/L氯化钠的0.02mol/LpH值为3.5～4.4的醋酸‑醋酸钠水溶液进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的艾塞那肽溶液取小样进行分析，将其中纯度大于95％的一段溶液收集待用；(5)换盐将步骤(4)得到的溶液用反相高效液相色谱法进行换盐，流动相A3为0.5mol/L的醋酸铵水溶液pH为3.8‑4.8，流动相A是体积分数0.2％的醋酸水溶液，流动相B3为纯乙腈，进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的艾塞那肽溶液取小样进行分析，将其中纯度大于98％的一段溶液收集待用；(6)冻干将步骤(5)中得到的纯度达到98％以上部分的溶液收集起来进行浓缩，浓缩后得到的浓缩液进行冻干。2.根据权利要求1所述的一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法，其特征在于，步骤1中粗品分析的流动相A为0.1％的磷酸水溶液，流动相B为0.1％的乙腈溶液，分析时间为20分钟，流动性相A的梯度是5‑95，流动相B的梯度是95‑5。3.根据权利要求1所述的一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法，其特征在于，步骤2中过滤的滤膜为0.45um的水系滤膜。4.根据权利要求1所述的一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法，其特征在于，步骤3中粗纯的时间为0‑40分钟，洗脱梯度是流动相A相20‑50，流动相B相80‑50。5.根据权利要求1所述的一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法，其特征在于，步骤4中的离子交换的洗脱时间为0‑40分钟，流动相A相为30‑70，流动相B相为70‑30。6.根据权利要求1所述的一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法，其特征在于，步骤5中色谱柱填料是十八烷基硅烷键合硅胶，洗脱时间为60分钟，前30分钟A3:B3按95：5的梯度进行等度洗脱，后30分钟A4相20‑50，B3相为80‑50进行梯度洗脱。7.根据权利要求1所述的一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法，其特征在于，步骤(6)收2CN112500473A权利要求书2/2页集的纯度大于98％艾塞那肽溶液减压浓缩至2‑6g/mL后转至冻干盘中冻干。3CN112500473A说明书1/7页一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法技术领域[00