重组艾塞那肽的生产工艺.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103911388103911388A(43)申请公布日2014.07.09(21)申请号201310483648.4C07K1/16(2006.01)(22)申请日2013.10.16(71)申请人东莞麦亘生物科技有限公司地址523000广东省东莞市松山湖高科技产业园区留创园15号楼3F(72)发明人李相鲁张严冬孟建军(74)专利代理机构深圳市君胜知识产权代理事务所44268代理人刘文求(51)Int.Cl.C12N15/70(2006.01)C12P21/02(2006.01)C07K14/575(2006.01)C07K1/22(2006.01)C07K1/18(2006.01)权权利要求书2页利要求书2页说明书11页说明书11页附图4页附图4页(54)发明名称重组艾塞那肽的生产工艺(57)摘要本发明公开重组艾塞那肽的生产工艺，包括构建工程菌的步骤、发酵表达工程菌的步骤和纯化目的蛋白的步骤；其中，本发明还包括对Exendin-4进行酰胺化处理的步骤。本发明利用了pET-31b(+)本身的可以大规模，高产量的生产多肽的优点，保留了它的功能强大的启动子，克服了目前其他生产工艺中该蛋白产物容易形成包涵体的缺点，利用了肠激酶的切割特性在目的蛋白的N末端进行切割，切割后的蛋白质完全是具有天然序列的Exendin-4。经过工程菌的发酵表达和目的蛋白的纯化后得到重组艾塞那肽。产量可以达到500mg/升以上，比目前最先进的工艺产量提高了20倍，且均为可溶性蛋白。CN103911388ACN10398ACN103911388A权利要求书1/2页1.一种重组艾塞那肽的生产工艺，包括构建工程菌的步骤、发酵表达工程菌的步骤和纯化目的蛋白的步骤；其中，构建工程菌的步骤包括：（1）重组Exendin－4多肽基因序列的人工合成：根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计编码Exendin－4的核苷酸序列，改造为如SEQIDNo.1所示的目的基因；（2）MAG2010质粒：取pET31b(+)质粒，切割掉SEQIDNo.2所示KSI融合基因片段，更换为SEQIDNo.3所示的基因，删除限制性内切酶AlwnI酶切位点和蛋氨酸和后继序列，取代以肠激酶酶切位点和目的蛋白的基因，切割掉组氨酸标记序列，在GB1蛋白的前面添加组氨酸标记，在目的蛋白的羧基末端添加双终止子；（3）工程菌的构建：按照启动子-6X组氨酸-GB1-tag-肠激酶的裂解位点-exedin-4-双终止密码子的顺序得到的基因片段，利用CloneEZ试剂盒连接到已经切割好的MAG2010质粒中，得到重组质粒pET-31(b+)-Exendin-4，将重组质粒pET-31(b+)-Exendin-4以CaCl2法转化受菌体BL21(DE3)plays，在37℃下在LB培养基中进行培养，收集菌体，筛选阳性克隆，作为重组Exendin-4融合表达的工程菌pET-31(b+)-Exendin-4/BL21(DE3)plays；发酵表达的步骤包括：（1）挑单菌落到装有30mL目标培养基中，31℃，200rpm活化过夜；（2）将30mL菌液接到200mL2XYT培养基中，32℃，200rpm培养约2.6hr；（3）以10％的接种量，接到5LMMBL培养基中，32℃，240rpm培养约3hr；（4）接到60L发酵培养基中；（5）控制生长期pH为6.8；用搅拌速度及通气量使DO≥10%；待培养基中葡萄糖的浓度降至0.2g/L时开始补料；当OD550达到10左右时加入13mL1MIPTG诱导，终浓度为0.2mM，把pH缓慢调至7.00，继续培养10小时后结束；纯化目的蛋白的步骤采用离子交换层析-柱层析-三明治型的亲和层析进行分离和纯化；该工程菌经过发酵、纯化得到的重组艾塞那肽的产量达到500毫克/升的产率；其特征在于，对Exendin-4进行酰胺化处理。2.根据权利要求1所述的重组艾塞那肽的生产工艺，其特征在于，所述酰胺化处理包括：将磁珠固定化的1.0mM的羧肽酶Y，或者1.0m的羧肽酶A溶于N-苯丙氨酸甲酯中，加入25毫升的氨水和0.4M的重组艾塞那肽，5mM的EDTA,反应体系总体积共计500毫升，在75℃下反应20个小时，8000rpm离心5分钟，氨化后的重组艾塞那肽，用HPLC进行纯化,用10%-100%甲醇或者乙腈溶液进行洗脱，收集样品，所得样品利用减压蒸发除去有机溶剂，重溶于醋酸盐缓冲液中，然后真空干燥得到白色粉末状艾塞那肽，并于-20℃保存。3.根据权利要求1所述的重组艾塞那肽的生产工艺，其特征在于，所述三明治型的亲和层析包括亲和层析一、酶裂解和亲和层析二，具体步骤如下：（1）亲和层析一：采用GE公司的IgG-se