一种噻苯咪唑半抗原制备方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN104341409104341409A(43)申请公布日2015.02.11(21)申请号201310328972.9(22)申请日2013.07.31(71)申请人北京勤邦生物技术有限公司地址102206北京市昌平区回龙观国际信息产业基地高新四街8号(72)发明人万宇平罗晓琴吴鹏韩京朋崔海峰蒲小容李海静刘春雪(51)Int.Cl.C07D417/04(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K16/44(2006.01)G01N33/543(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书8页说明书8页附图2页附图2页(54)发明名称一种噻苯咪唑半抗原制备方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种噻苯咪唑半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体，同时本发明也公开了所述噻苯咪唑半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体的制备方法及其应用。本发明提供的噻苯咪唑半抗原是式1所示产物，用式1所示产物与载体蛋白连接可以得到噻苯咪唑抗原。所述噻苯咪唑抗原可应用于制备噻苯咪唑特异性抗体。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明的噻苯咪唑人工抗原，通过免疫动物可产生了针对噻苯咪唑的特异性抗体，可用于制备检测噻苯咪唑残留的酶联免疫检测试剂盒，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。CN104341409ACN10439ACN104341409A权利要求书1/1页1.一种噻苯咪唑半抗原，为式1所示产物：式1。2.式1所示产物的制备方法，包括如下步骤：取5-羟基噻苯咪唑220mg、邻苯二甲酸酐500mg和吡啶2mL在20mL二甲基亚砜中混合后，于80℃下搅拌反应10小时，蒸除溶剂，柱层析纯化得到式1所示产物，即邻苯二甲酸单噻苯咪唑酯。3.一种噻苯咪唑抗原，是将式1所示产物和载体蛋白偶联得到的偶联物。4.权利要求3所述噻苯咪唑抗原的制备方法，包括如下步骤：（1）取式1所示产物10mg，溶解于1mL二甲基甲酰胺中；（2）取氯甲酸异丁酯50μL，于4℃下搅拌24h，即可得到反应液A；（3）称取载体蛋白50mg，加入pH9.0的碳酸盐缓冲液3.8mL，充分溶解，将反应液A逐滴滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌反应24h；（4）用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；（5）分装，于-20℃保存备用。5.权利要求3所述噻苯咪唑抗原在制备噻苯咪唑特异性抗体中的应用。6.应用权利要求3所述噻苯咪唑抗原制备得到的特异性抗体。7.权利要求1所述产物、权利要求3所述噻苯咪唑抗原、权利要求6所述抗体在检测噻苯咪唑中的应用。8.应用权利要求1所述产物、权利要求3所述噻苯咪唑抗原、权利要求6所述特异性抗体制备得到的酶联免疫检测试剂盒。9.权利要求8所述酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，它包括：包被有噻苯咪唑抗原的酶标板、酶标抗体工作液、噻苯咪唑系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。2CN104341409A说明书1/8页一种噻苯咪唑半抗原制备方法及其应用技术领域[0001]本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种噻苯咪唑半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法及其应用。背景技术[0002]噻苯咪唑英文名TBZ(Thiabendazole)，别名：特克多；腐绝；硫苯唑；涕灭灵，分子式：C10H7N3S，分子量：201.25，原药为白色粉末，熔点：304～305℃，310℃升华。室温时溶解度为：丙酮28g/L，甲醇9.3g/L，二甲基亚砜80g/L，二甲基甲酰胺39.0g/L，苯2.3g/L，氯仿0.8g/L。在中性及酸性、碱性水溶液中稳定。[0003]噻苯咪唑属于苯并咪唑类药物(benzimidazoles，BMZs)，为广谱、高效、低毒驱肠虫药，由于对对蛔、钩、鞭、蛲、粪圆线虫和旋毛虫感染，均有驱除作用，至今仍在广泛使用。噻苯咪唑可引起食欲不振、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、眩晕、头痛、嗜睡及黄视等。农业部235号公告规定了动物源性食品中噻苯咪唑的残留限量为100μg/kg。[0004]目前的TBZ检测方法多为色谱法，但是需要复杂昂贵的仪器，且样品前处理过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。该技术研究的关键是半抗原分子的设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。因为TBZ是小分子化合物，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白偶联得到具有免疫原性的人工抗原。在此基础上建立起来的酶联免疫检测试剂盒可快速、方便、准确的检测牛奶中的TBZ残留，可为建立监控动物源性食品中TBZ残留提供技术支持。发明内容[0005