一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104630318A(43)申请公布日2015.05.20(21)申请号201510029499.3(22)申请日2015.01.21(71)申请人华南理工大学地址510640广东省广州市天河区五山路381号(72)发明人张学武何胜洁(74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102代理人何淑珍(51)Int.Cl.C12P21/06(2006.01)C07K1/34(2006.01)A61K38/01(2006.01)A23L1/29(2006.01)A61P35/00(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图2页(54)发明名称一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法(57)摘要本发明提供一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法。该方法为：取3～20g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为10～50%(w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，酶解完毕后灭酶，冷至室温，将酶解液离心，取上清液；依次用截留分子量分别为10KD、5KD以及3KD的超滤膜过滤，从而获得3种酶解液；0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶SephadexG-15柱层析，水洗脱，在一定的检测波长下收集得到4个多肽组分，即金钱龟抗肿瘤多肽。本发明得到的金钱龟多肽有利于抗肿瘤药物和保健食品的开发利用。CN104630318ACN104630318A权利要求书1/1页1.一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）取3～20g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为10～50%(w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，水解过程中使用0.05～0.2mol/L的NaOH或HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间，酶解完毕后灭酶，冷至室温，将酶解液离心，取上清液；（2）取步骤（1）得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10KD、5KD以及3KD的超滤膜过滤，从而获得分子量大小范围为0-3KD、3-5KD和大于10KD的金钱龟多肽的酶解液；（3）取步骤（2）得到的0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶SephadexG-15柱层析，水洗脱，按照出峰的时间顺序，分别收集得到4个多肽组份分别命名为E1、E2、E3和E4，即金钱龟抗肿瘤多肽。2.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述胰蛋白酶水解条件是：pH=7～9，酶解温度30～60℃，酶解时间4～15h，酶与底物浓度比为0.1%～0.5%（w/w）。3.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述灭酶为在80～100℃水中灭酶10～20min。4.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述离心为在6000～10000r/min下离心30～60min。5.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于步骤（2）所述的超滤在CO2的压力为0.1～0.25Mpa的室温下用超滤杯结合超滤膜超滤。6.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的葡聚糖凝胶SephadexG-15分离纯化，具体条件为：柱体积为100～200mL，上样量为1～4mL，上样浓度为20～150mg/mL，流动相为水，流速为0.3mL/min，每4min收集一管，总共收集110管，检测波长为218nm。7.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于步骤（3）所述金钱龟抗肿瘤多肽组份中E1和E2经MALDI-TOF-TOF质谱分析鉴定得到其中三条肽序列为PGVKGPR、SSPGPPVH和KLGPKGPR。2CN104630318A说明书1/4页一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法。背景技术[0002]金钱龟（CuoraTrifasciata）又名三线闭壳龟，具有极高的药用价值。古代东汉时期《神农本草经》、战国时期《山海经》都有龟类食用药用的记载；金钱龟对解毒、消炎、益肝、补肾效果明显,常被用作保健养颜、防治肿瘤和长寿健体的主药之一。金钱龟所含的活性因子较高，对于治疗血小板减少，细胞败死有一定的效果，并且可以抑制癌细胞的生长，促进人体中的血液循环。[0003]生物活性肽（biologicallyactivepeptides,BAP）是一种具有特殊生理功能的小分子活性物质，如抗肿瘤、抗菌、抗高血压、抗病毒以及提高免疫力等，这些物质广泛存在于动物、植物以及微生物中。不同的生物活性肽其结构有很大的差异，既有简单的二肽又有复杂结构的环肽和线肽，它们在体内非常容易被消化吸收。生物活性肽主要有4种来源，分别为蛋白酶