一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104561208A(43)申请公布日2015.04.29(21)申请号201510031433.8A61P35/00(2006.01)(22)申请日2015.01.21(71)申请人华南理工大学地址510640广东省广州市天河区五山路381号(72)发明人张学武王竹君(74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102代理人何淑珍(51)Int.Cl.C12P21/06(2006.01)C07K7/06(2006.01)C07K1/36(2006.01)C07K1/34(2006.01)C07K1/16(2006.01)权利要求书2页说明书5页附图2页(54)发明名称一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法(57)摘要本发明提供一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法。该方法为：取螺旋藻粉，用超纯水配制成浓度为5%的溶液，反复冻融后，冰浴中均质、超声，离心取上清液，冷冻干燥备用；将其配置成的蛋白液，加入胃蛋白酶进行酶解，控制pH值，加入胰蛋白酶进行酶解，加入胰凝乳蛋白酶进行酶解，控制pH值，灭酶，冷却，离心，取上清液；依次用截留分子量分别为10KD、5KD以及3KD的超滤膜过滤，获得三种螺旋藻蛋白酶解液；将0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶SephadexG-15柱层析，水洗脱，收集得到4个多肽组分，即螺旋藻抗肿瘤多肽。本发明得到的螺旋藻多肽和单肽组分，为抗肿瘤药物和保健食品的开发利用奠定了理论基础。CN104561208ACN104561208A权利要求书1/2页1.一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）取10~50g螺旋藻粉，用超纯水配制成浓度为5%(w/v)的溶液，反复冻融2-5次，冰浴中均质、超声，离心取上清液，冷冻干燥备用；（2）取步骤（1）得到的螺旋藻蛋白配置成1%~5%的蛋白液，加入胃蛋白酶在控制条件下进行酶解，酶解过程中使用0.05～0.2mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间，酶解完后再调节酶解条件，加入胰蛋白酶在控制条件下进行酶解，酶解体系的pH值控制方法同上，之后加入胰凝乳蛋白酶在控制条件下进行酶解，酶解体系的pH值控制方法同上，酶解完毕后灭酶，冷却至室温，将酶解液离心，取上清液；（3）取步骤（2）得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10KD、5KD以及3KD的超滤膜过滤，从而获得分子量大小范围为0-3KD、3-5KD，5-10KD和大于10KD的螺旋藻蛋白酶解液；（4）取步骤（3）得到的0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶SephadexG-15柱层析，水洗脱，按照出峰的时间顺序，收集得到4个多肽组分，分别命名为Tr1、Tr2、Tr3和Tr4，即螺旋藻抗肿瘤多肽。2.根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法，其特征在于，步骤（1）所述反复冻融条件为：-20℃冰箱中冷冻4~8h，再置于37℃水浴中解冻2~3h；所述均质条件为：样品置于冰浴中均质1~3min，在转速为3000~5000rpm搅拌20~50s，然后在7000~12000rpm搅拌40~80s，最后在3000~5000rpm搅拌20~50s。3.根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法，其特征在于，步骤（1）所述超声条件为：样品置于冰浴中，以460~670W的功率超声20~15min，超声过程中每超声4~8s，间隔6~10s再继续超声4~8s，如此循环。4.根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法，其特征在于，步骤（1）所述离心条件为：4℃，8000~10000r/min，离心30~60min。5.根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法，其特征在于，步骤（2）胃蛋白酶、胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶三酶解的水解条件是：加入胃蛋白酶，酶解温度37℃，pH=1~2，酶解时间1~3h，酶与底物浓度比为4~6%（w/w），加入胰蛋白酶，酶解温度37℃，pH=7~9，酶解时间2~4h，酶与底物浓度比为3~5%（w/w），加入胰凝乳蛋白酶，酶解温度37℃，pH=7~9，酶解时间2~4h，酶与底物浓度比为4~6%（w/w）。6.根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法，其特征在于，步骤（2）所述灭酶条件为：80~95℃水浴灭酶10~15min。7.根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法，其特征在于，步骤（2）所述离心条件为8000~10000r/min，离心30~60min。8.根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的超滤在CO2压力为0.1～0.25MPa的室温下用超滤杯结合