金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104531818A(43)申请公布日2015.04.22(21)申请号201510029417.5(22)申请日2015.01.21(71)申请人华南理工大学地址510640广东省广州市天河区五山路381号(72)发明人张学武何胜洁(74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102代理人何淑珍(51)Int.Cl.C12P21/06(2006.01)C07K1/34(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图1页(54)发明名称金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法(57)摘要本发明提供金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法。该方法为：取3～20g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为10～50%(w/v)的混合溶液，取质量和浓度都相同的混合溶液三份，分别加入木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶37017和复合蛋白酶Protamex，在控制条件下进行酶解，酶解完毕后灭酶，冷至室温，将酶解液离心，取上清液，得到三种酶解液；依次用截留分子量分别为10KD、5KD以及3KD的超滤膜过滤，每种酶解液分别获得3种金钱龟多肽的酶解液。所得产品对乳腺癌细胞（MCF-7）和肝癌细胞（HepG-2）均具有抑制作用。所以本发明得到的金钱龟多肽有利于抗肿瘤药物和保健食品的开发利用。CN104531818ACN104531818A权利要求书1/1页1.金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于,包括如下步骤：（1）取3～20g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为10～50%(w/v)的混合溶液，取质量和浓度都相同的混合溶液三份，分别加入木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶37017和复合蛋白酶Protamex，进行酶解，酶解过程中使用0.05～0.2mol/L的NaOH或HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间，酶解完毕后灭酶，冷至室温，将酶解液离心，取上清液，得到三种酶解液；（2）取步骤（1）得到的三种酶解液，依次用截留分子量分别为10KD、5KD以及3KD的超滤膜过滤，每种酶解液分别获得分子量大小范围为0-3KD、3-5KD和大于10KD的金钱龟多肽的酶解液。2.根据权利要求1所述的金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述木瓜蛋白酶水解条件是：pH=6～8，酶解温度45～65℃，酶解时间6～12h，酶与底物浓度比为0.2～0.7%（w/w）。3.根据权利要求1所述的金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述碱性蛋白酶37017水解条件是：pH=6～9，酶解温度30～60℃，酶解时间4～14h，酶与底物浓度比为2～7%（w/w）。4.根据权利要求1所述的金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述复合蛋白酶Protamex水解条件是：pH=5～9，酶解温度35～55℃，酶解时间3～10h，酶与底物浓度比为0.2～0.8%（w/w）。5.根据权利要求1所述的金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述灭酶为在80～100℃水中灭酶10～20min。6.根据权利要求1所述的金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述离心为在6000～10000r/min下离心30～60min。7.根据权利要求1所述的金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的超滤在CO2的压力为0.1～0.25MPa的室温下用超滤杯结合超滤膜超滤。2CN104531818A说明书1/4页金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法。背景技术[0002]金钱龟（CuoraTrifasciata）又名三线闭壳龟，具有极高的药用价值。古代东汉时期《神农本草经》、战国时期《山海经》都有龟类食用药用的记载；金钱龟对解毒、消炎、益肝、补肾效果明显,常被用作保健养颜、防治肿瘤和长寿健体的主药之一。金钱龟所含的活性因子较高，对于治疗血小板减少，细胞败死有一定的效果，并且可以抑制癌细胞的生长，促进人体中的血液循环。[0003]生物活性肽（biologicallyactivepeptides,BAP）是一种具有特殊生理功能的小分子活性物质，如抗肿瘤、抗菌、抗高血压、抗病毒以及提高免疫力等，这些物质广泛存在于动物、植物以及微生物中。不同的生物活性肽其结构有很大的差异，既有简单的二肽又有复杂结构的环肽和线肽，它们在体内非常容易被消化吸收。生物活性肽主要有4种来源，分别为蛋白酶解多肽、微生物发酵代谢多肽、天然活性多肽以及化学合成多肽。其中酶解法不仅产量大、成本低、反应过程不会产生有害物质而且此方法所得到的抗肿瘤多肽活性比较强，安全性相对比较高，所以成为了目前主要的活性肽合成方法。[0004]由于近