检测脱氧核糖核酸酶的DNA探针、试剂盒和方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105648062A(43)申请公布日2016.06.08(21)申请号201610076852.8(22)申请日2016.02.03(71)申请人广州市锐博生物科技有限公司地址510663广东省广州市科学城科学大道182号创新大厦C3-13(72)发明人张必良刘霭珊曹亮克雷格·梅洛(74)专利代理机构广州华进联合专利商标代理有限公司44224代理人万志香胡杰(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/34(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书11页序列表2页附图5页(54)发明名称检测脱氧核糖核酸酶的DNA探针、试剂盒和方法(57)摘要本发明提供一种检测脱氧核糖核酸酶活性的DNA探针、试剂盒和方法，采用发夹状DNA探针为脱氧核糖核酸酶的底物，探针的两端或内部分别标记上荧光基团及对应的荧光淬灭基团。当探针结构完整时，荧光基团与淬灭基团位于同一个DNA分子上，荧光基团被激发的荧光被淬灭基团吸收，荧光基团不发出荧光；而当探针被脱氧核糖核酸酶降解后，荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团能正常发出荧光。采用实时定量PCR仪检测反应体系中发出的荧光强度，即可判断反应体系中是否存在脱氧核糖核酸酶。本方法可广泛用于生物制品中脱氧核糖核酸酶残留的质量检测，或用于脱氧核糖核酸酶定量测定。CN105648062ACN105648062A权利要求书1/1页1.一种DNA探针，其特征在于,其包含有一个茎环结构，且2个末端或内部分别连接有能量供体基团和能量受体基团，能量供体基团和能量受体基团之间能进行能量转移,所述DNA探针的碱基长度为15-50个核苷酸，且包含一个能被DNase切割的位点，被降解后的探针的能量供体基团和能量受体基团在不同的探针片段上；所述茎环结构中，其茎结构包括分别位于探针两端的5～15bp的回文互补序列，其环结构包括长度为5～20nt的核苷酸序列，探针退火后形成茎环结构，两个回文互补部分Tm值大于35℃。2.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述茎环结构中，其茎结构包括至少一个T，其环结构包括至少一个1个A、1个C、1个T和1个G。3.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于,所述能量供体基团为荧光基团，所述能量受体基团为其对应的荧光淬灭基团。4.根据权利要求3所述的DNA探针，其特征在于,所述荧光基团和荧光淬灭基团选自FAM、TAMRA、HEX、CY染料、BQH、Dabcy1。5.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于,所述DNA探针选自如SEQIDNO.1—SEQIDNO.8所示中的至少一条。6.根据权利要求1-5任一项所述的DNA探针，其特征在于,所述DNA探针至少包括一个具脱氧核糖核酸酶抗性和/或提高酶解特异性的修饰的核糖核苷酸。7.根据权利要求6所述的DNA探针，其特征在于,所述DNA探针的末端的核糖核苷酸为硫代磷酸核糖核苷酸。8.一种脱氧核糖核酸酶的检测试剂盒，其特征在于,包括有权利要求1-7任一项所述的DNA探针。9.一种脱氧核糖核酸酶的检测方法，其特征在于,该方法包括以下步骤1)制备如权利要求1-7任一项所述DNA探针作为底物；2)将待检测样本与步骤1)中所述底物接触；3)PCR荧光定量检测，检测步骤2)接触反应后的底物的荧光强度。10.根据权利要求9所述的脱氧核糖核酸酶的检测方法，其特征在于,其步骤还包括在PCR荧光定量检测之前在反应体系中加入缓冲液，所述缓冲液成分包括0.01～5MNaCl,0.01～5MKCl,50mM～1MTris-HCl,10～100mMMgCl2，缓冲液的pH值6.5～9.0。2CN105648062A说明书1/11页检测脱氧核糖核酸酶的DNA探针、试剂盒和方法技术领域[0001]本发明涉及酶检测领域，具体而言，涉及脱氧核糖核酸酶的检测方法及一种脱氧核糖核酸酶检测DNA探针和试剂盒。背景技术[0002]脱氧核糖核酸酶(DNase酶)普遍存在于细胞中，参与了多种生理生化过程，例如DNA复制和修复、细胞凋亡等。其也可用作疾病的标志物，如在关节炎、肾炎患者体内，其DNA酶I表达水平低[Nadano,D.；Yasuda,T.；Kishi,K.MeasurementofdeoxyribonucleaseIactivityinhumantissuesandbodyfluidsbyasingleradialenzyme-diffusionmethod.Clin.Chem.1993,39,448–452.]；DNase酶也可用于疾病的治疗，如DNaseI可用于治疗囊性纤维瘤。[0003]传统的DNase检测方法包括高效液相色谱(HPLC)或酶联免疫吸附试验(